蓖麻蚕卵天冬氨酸蛋白酶 纯化及性质

动物学报　43(2):133～139,1997

A cta Zoologica S i nica

蓖麻蚕卵天冬氨酸蛋白酶

纯化及性质3

赵小凡 王金星

(山东大学生物学系,济南　250100)

摘　要　采用硫酸铵沉淀、离子交换层析和离子交换凝胶过滤法,从蓖麻蚕卵母细胞中纯

化出一种蛋白酶。该蛋白酶活性能被天冬氨酸蛋白酶特异性抑制剂抑胃肽抑制,初步鉴定

该酶为天冬氨酸蛋白酶。经SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳测得分子量为90kD,由凝胶过滤估

计分子量在360kD,推测该酶由四亚基组成。该蛋白酶在p H3～5均可水解牛血红蛋白,最

适p H为4。这是首次报道昆虫卵内存在天冬氨酸蛋白酶。

关键词　蓖麻蚕　卵天冬氨酸蛋白酶　纯化　性质

昆虫卵内蛋白酶在胚胎发育中降解卵黄蛋白,供给胚胎发育必需的氨基酸,对昆虫的胚胎发育具有重要的意义。根据活性中心可将蛋白酶分为4大类,分别是半胱氨酸蛋白酶类、丝氨酸蛋白酶类、天冬氨酸蛋白酶类和金属蛋白酶类(Bond and Butler, 1987)。目前已从昆虫卵内纯化出多种蛋白酶,如家蚕卵半胱氨酸蛋白酶(Kageyama and Takahashi,1990)和家蚕卵黄蛋白质降解酶(Ikeda et al.,1990)。目前所报道的昆虫卵内蛋白酶分属于半胱氨酸蛋白酶类和丝氨酸蛋白酶类。前者的活性中心含有半胱氨酸残基,酶活性可被E264{N2[N2(1,32trans2carboxyoxiran222carbonyl)2L2leucyl]2agma2 tine}抑制;后者活性中心含有丝氨酸残基,酶活性可被iPr2P2F(diisopropyl fluorophos2 phate)抑制。目前为止,还没有关于昆虫卵内是否存在有天冬氨酸蛋白酶的报道。

在我们对蓖麻蚕卵内半胱氨酸蛋白酶进行研究的过程中发现,卵母细胞中的内源性蛋白酶活性除可被半胱氨酸蛋白酶特异性抑制剂E264抑制外,还可被天冬氨酸蛋白酶的特异性抑制剂抑胃肽抑制,在纯化蓖麻蚕卵半胱氨酸蛋白酶时也发现多个蛋白酶活性峰,因此曾推测蓖麻蚕卵内可能存在有天冬氨酸蛋白酶(赵小凡等,1994)。现从蓖麻蚕卵母细胞中纯化出一种蛋白酶,由于其活性可被抑胃肽抑制,初步鉴定该酶为天冬氨酸蛋白酶类。

1　材料和方法

111　动物　蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini)用蓖麻叶人工饲养,取羽化前的剖腹卵洗净备用。112　化学试剂　DEAE2纤维素(DE252)为Whatman公司产品;DEAE2Toyopearl为日本Tosoh公司产品;Sepharose CL26B和标准蛋白质为Pharmacia公司产品;部分抑制剂由S.Y.Takahashi教授惠赠;蓖麻蚕卵黄磷蛋白(分子量468kD,刘正廉等,1987)和蓖麻蚕卵半胱氨酸蛋白酶(分子量

　1994206207收稿,1997202218修回

3国家教委留学回国人员基金及优秀年轻教师基金资助项目

158kD,)由本实验室纯化,参照赵小凡等(1994)方法进行,其余试剂为分析纯产品。

113　方法　

11311　蛋白酶活性分析　以2%的牛血红蛋白做底物,p H316,加入待测样品,在37℃温育1小时,取5%的三氯醋酸(TCA)终止反应,经10000g离心10分钟,取上清液按Lowry法染色,测750nm 吸收值。一个活力单位定义为:每分钟蛋白酶与底物反应所得产物的吸光值,以01001表示。

11312　蛋白质含量测定　采用Lowry法。

11313　十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PA GE)按Laemmli(1970)方法进行。

11314　蛋白酶纯化　参照K ageyama和Takahashi(1990)方法进行,全部纯化过程在4～10℃进行。50g卵母细胞经过匀浆、硫酸铵沉淀、DEAE2纤维素层析和DEAE2Toyopearl离子交换凝胶过滤等步骤进行纯化,纯化产物纯度由SDS2PA GE检测。

11315　抑制实验　取纯化的蛋白酶30μg与不同的抑制因子混合后,加到200μl2%的牛血红蛋白中,按活性检测方法测750nm吸光值。

11316　蛋白酶对底物的敏感性　在不同p H条件下,将50μg纯化的蛋白酶加入200μl015%的底物中,在37℃温育1小时,按活性检测方法测750nm吸光值。

11317　分子量测定　亚基分子量由SDS2PA GE测定,全酶分子量由Sepharose CL26B凝胶过滤测定(215×60cm)。

2　结　果

蓖麻蚕卵50g经匀浆、硫酸铵沉淀和层析,获得215mg天冬氨酸蛋白酶,总活力为2178U,比活为1111,产率为5117%。纯化程序及产率计算见表1。

表1　蓖麻蚕卵天冬氨酸蛋白酶纯化

T able1　Purif ication of an aspartic proteinase from the eggs of Philosamia cynthia ricini

步骤Steps

总蛋白

Total protein

(mg)

总活力(单位)3

Total activity

(units)

比活(总活力/

总蛋白)

Specific activity(Total

activity/Total protein)

产率(每步总活力/第一步

总活力)(%)

Y ield(Total activity in each

step/Total activity in first step)

卵匀浆液5000531750101100 (Homogenate of oocytes)

45%硫酸铵沉淀30003511001016513

(Precipitation by45%

ammonium sulfate)

DEAE2纤维素(DEAE252)7033180014862188离子交换凝胶(I)171511183016822101

(1st DEAE2Toyopearl)

离子交换凝胶(Ⅱ)215217*********

(2nd DEAE2Toyopearl)

3一个活力单位定义为:每分钟蛋白酶与底物反应所得产物的吸光值,以01001表示(One unit is defined as01001 of the absorbance after reaction of proteinase and substrate in1minute.)

在DEAE纤维素层析中,活性部分位于蛋白质高峰之后,在第49～52管处,洗脱431动 物 学 报43卷