微生物工程实验-黑曲霉发酵生产a-淀粉酶

黑曲霉发酵生产a-淀粉酶
姓名：专业：09生物技术学号：09121007
摘要：本实验按照5%的接种量向10L机械搅拌式发酵罐接种，并测量了发酵期间的PH、生物量、酶活、残糖等参数随时间的变化，每6h取样检测一次，发酵三天后放罐（大约66h），并分析了参数变化的原因，从而得到黑曲霉生产a-淀粉酶各种物质和理化性质的变化。

关键词：黑曲霉发酵 a-淀粉酶生物量 pH 酶活残糖含量
一、材料和方法：
1.1材料
菌种：黑曲霉
PDA培养基：土豆200g（去皮）煮沸30min过滤，加糖20g，加水定容至1L.
碘液：称取0.5gI2 ,5.0gKI，研磨溶解于少量蒸馏水，定容至100ml，褐色溶剂瓶内保存，避免阳光直射。

稀碘液：取原碘液1ml稀释100倍。

此溶液现配现用。

0.5%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉0.5g，加5ml缓冲液搅拌混合，再徐徐倾入70ml煮沸的缓冲液中，继续煮沸2min，冷切至室温，定容至100ml。

此溶液需要当天配制。

KH2PO4 30g;
CaCl2 1.0g;七水硫酸亚铁 0.1g；七水硫酸镁 0.1g；水 14L（12L 蒸馏水加上后来在发酵罐中产生的冷凝水差不多是14L），pH调至5.00；消泡剂 4.0mL。

〃
蒽酮试剂：溶解0.2g蒽酮于浓硫酸1L中，当天配制使用。

1.2方法
1.21菌种制备
先配制好PDA培养基，分装好，向各瓶中接入黑曲霉，170rpm 摇瓶，28°c培养。

1.22设备
发酵罐主要部件：罐身、搅拌器、挡板、冷却装置、空气分布装置、轴承、夹套、进料口、补料口、取样口等
水通道：分为冷却水和夹套水。

冷却水可以使培养基降温，在发酵过程中，可以和夹套水一起控制发酵温度，夹套水为循环水，可以冷却也可以保温。

空气通道：空气经空压机压缩后，进入储气罐，经油水分离进入玻璃转子流量计，经过滤器后，进入罐底的空气分布器，尾气经罐顶过滤器后排出。

1.23空消
打开蒸汽发生器开关，等其压力上升到0.2Mpa,然后打开发酵罐上与之连通的相应的一些阀门，使蒸汽进入其中，当温度上升到121℃压强在0.1-0.15Mpa之间，稍微打开蒸汽出气口使体系温度和压强维持稳定，灭菌20min左右，结束后关闭蒸气管路，打开管道。

1.24实消
把配好的8L培养基由进料口加入，加4ml消泡剂，打开蒸汽管道以及相关阀门，121℃灭菌30 min，灭菌结束后，打开冷凝水的通道，关闭蒸汽管道，打开空气管道。

1.25接种
待罐内温度降至28℃时，在进样口附近用酒精棉球点火，接入上述培养好的菌种。

1.26发酵
发酵过程中要注意罐内的温度、压强等参数是否正常，每隔6h 取样一次
二、实验方法
2.1 pH值得测定
将每次取得的发酵液用pH计进行测量，记录每次数据。

2.2生物量的测定
每隔六个小时物一次样，取10ml样品于离心管中，对所取的样品进行离心5000rpm，10min；所得上清液（即酶液）倒入一干净试管中保留，以便用于后面的酶活力和残糖含量的测定；弃去上清液后，向离心管中加入10ml水洗涤，混匀，再次离心，5000rpm，10min，离心之后弃上清，将得到的沉淀物刮至培养皿中放到180℃的烘箱中烘干，2-3小时后拿出来称量即为该批次的生物量（事先称好培养皿
的重量）。

2.3酶活力的测定
设立对照组，空白组和实验组。

空白组：0.5ml 蒸馏水+5.0ml 稀碘液；
对照组：5.0ml0.5%淀粉→40℃预热10min→加入0.5mL缓冲液→反应5min→加入5.0mL 0.1mol/L硫酸终止反应→从反应体系中取出0.5ml的反应液加入5.0mL的稀碘液中
实验组：5.0ml0.5%淀粉→40℃预热10min→加入0.5mL稀释酶液→反应5min→加入5.0mL0.1mol/L硫酸终止反应→从反应体系中取出0.5ml的反应液加入5.0mL的稀碘液中
对上述所得的溶液进行可见光分光光度计法测量，记下数值并标明稀释倍数D。

2.4残糖的测定
本实验残糖的测定方法采取的是硫酸蒽酮法。

设定的空白组是1.0mL 的蒸馏水加入4.0mL的硫酸蒽酮溶液；实验组是1mL的稀释的残糖溶液加入4.0mL硫酸蒽酮溶液（三个平行组，并在冰水浴进行）。

置沸水浴10min，再置于冰水浴中冷却10min，在620nm处测吸光光度值。

三、实验数据记录
3.1发酵液pH值的变化
pH值随时间的变化趋势
3. 2生物量的变化
生物量随时间的变化趋势
3.3酶活的变化
酶活随时间的变化趋势
3.4残糖的变化
残糖随时间的变化趋势
3.5残糖的标准曲线
四、实验结果分析
1、pH值得变化是0-18h变化幅度不大，，此时是由于黑曲霉在发酵罐中的延迟效应，也就是菌处于潜伏期内种代谢不旺盛，故pH的变化不大。

随后随着菌种的活化，菌种新陈代谢的旺盛CO2的释放增加，pH值逐渐下降。

理论上pH值大体上是呈下降趋势，且下降速度逐渐加快；但实验结果变动的幅度不大，这可能是接入的的黑曲霉量较少，也有可能是实验过程中没有很好的控制温度，是菌种不能处于最是的生长环境。

除此之外，我们组的发酵罐没有搅拌设备也是影响因素之一。

在曲线中第九、十组数据出现上升现象,这可能是在取样的烧杯没洗干净,由于其壁上残留有酸性物质.
2、从图上可以直观地看出生物量整体上是呈上升趋势,这是因为在发酵期间培养基的营养成分是够黑曲霉生长所需的,它的增殖受到环境的影响不是很大,故其一直在增殖,表现为生物量整体上呈上升状态.至于在第六组的数据明显高于其他组可能是沉淀没有完全烘干或者在操作过程中有杂质混入。

第十组数据偏低，可能是离心不彻底使部分物资损失。

此外生物量曲线出现较大的波动可能是操作过程中，因为操作者的疏忽导致温度变化较大，使菌种处于不适的生长环境中所致。

3、a-淀粉酶的活力总体上是呈上升趋势，在发酵初期，由于菌种的代谢慢，总量少，所以0-36h内酶活测定数值比较小，上升幅度也较小，此后，由于菌种达到对数期和稳定期黑曲霉的产酶能力加强，酶活不断升高，且上升幅度也大大提高，；从总体上看酶活值的变化是越来越大,在开始的一段时间内酶活值的变化幅度不大,这是因为刚开始黑曲霉接种到发酵罐里,有一段时间的延滞期,尽管时间不长;而且刚开始黑曲霉的数量相对于发酵罐中的培养基的量而言毕竟是少的，因此导致曲线开始阶段变化较缓慢，以后的时间里黑曲霉大量增殖，数量增加以后产生的酶量便不断增加。

通过观察可以发现实验结果的第六组合第八组出现先将现象，可能是温度变化较大的影响，也可能是对酶液稀释倍数不合理所致。

4、残糖的变化理论上应该是越来越小，但是实验中残糖的波动比较大，归结原因可能如下：
①试验中所使用的蒽酮和淀粉溶液不是现配现用，尤其是淀粉溶液时间稍长就会出现沉淀，这是结果波动性变化大的最主要的原因；
②操作不规范，稀释倍数不合理，也可能导致数据波动性较大
③发酵罐中的温度没有控制好，对此也有较大影响。

五、实验收获
通过本次试验我们直观地观察了微生物发酵的过程，并有较大的收获，因为这些操作是在书本上学不到的.而且体会到要想做好实验我们必须细心,注意观察并发现实验中所出现的问题及时想办法解决.实验过程中仅仅看别人操作是不行的,那样只能是眼高手低,我们要自己动手,不懂的向老师同学学习.在一组合作的同学之间要相互合作,认真完成自己的本分工作并且相互帮助.在操作过程中我们要严格自己的操作,实验测量的数据要保持真实性,对于不正确的结果我们要重新测量,不能因为麻烦而不愿重新操作，要有负责的态度。

因为这次实验过程很接近工厂发酵操作，对我们以后从事相关行业工作有很大帮助。