对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM

对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM 作者：田蓉，程绍辉，于继云，李巍，刘玉峰

【关键词】黑色素瘤

Inhibition of lung metastasis of B16 melanoma cells transfected with murine granulocytemacrophage colonystimulating factor in mice

【Abstract】AIM: To investigate the inhibition of lung metastasis of melanoma by a tumor vaccine of B16 melanoma cells transfected with murine granulocytemacrophage colonystimulating factor (mGMCSF). METHODS: The murine melanoma cell line B16 was transfected with the recombinant plasmid containing mGMCSF. A cell line stably expressing mGMCSF was obtained by G418 selection. The Balb/c mice were administered i.v. with B16 cells transfected with or without mGMCSF respectively and the lung metastasis was examined 2 weeks later. RESULTS: The recombinant cell line B16TR was established after mGMCSF tranfection and the expression of mGMCSF was confirmed by RTPCR. The number of lung metastatic lesions of mice treated

with B16TR was significantly fewer than that of mice treated with B16 (n=5, 125.8

±34.3 vs 27.8±24.0, P<0.01). CONCLUSION: The mGMCSF transfection can significantly suppress the lung metastasis of melanoma in mice. The GMCSF can be a promising adjuvant in the immunotherapy of melanoma.

【Keywords】melanoma; mice; granulocytemacrophage colonystimulating factor; lung neoplasms/secondary; cancer vaccines

【摘要】目的：探讨小鼠粒细胞巨噬细胞－集落刺激因子（mGMCSF）基因转导对B16黑色素瘤细胞肺转移的抑制效果. 方法：应用脂质体将含有mGMCSF基因的真核表达载体转染B16小鼠黑色素瘤细胞，经G418加压筛选后，挑选表达mGMCSF基因的B16黑色素瘤细胞. 观察转导或未转导mGMCSF基因的B16黑色素瘤细胞在Balb/c小鼠体内的肺转移. 结果：转导mGMCSF 基因的B16黑色素瘤细胞可以稳定表达mGMCSF，在小鼠模型上其肺转移灶数目显著少于未转染基因的黑色素瘤细胞对照组，二者差异显著（n=5, 125.8±34.3 vs 27.8±24.0, P<0.01）. 结论： mGMCSF转导可显著抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的肺转移，提示GMCSF具有治疗黑色素瘤的临床应用前景.

【关键词】黑色素瘤；小鼠；粒细胞巨噬细胞－集落刺激因子；肺肿瘤/继发性；癌症疫苗

0引言

黑色素瘤是一种恶性程度很高的恶性肿瘤，早期即可发生肺、脑转移. 其发病率有逐渐增高的趋势，然而目前尚无有效的治疗方法［1-3］. 近年来，免疫治疗已经成为黑色素瘤治疗研究的一个热点［2,4-5］，其中，联合细胞因子的肿瘤细胞免疫是一个重要的方向，可以涉及几乎全部与免疫系统相关的细胞因子. GMCSF具有可增强粒细胞、巨噬细胞活性，增强MHCⅠ, MHCⅡ, B7分子的表达，增强抗原提呈功能等广泛的生物学活性，因而可能在肿瘤的免疫治疗中具有着重要作用. 我们拟将GMCSF基因转染黑色素瘤细胞系B16，观察其对黑色素瘤细胞生长及转移的影响，为抗黑素瘤免疫治疗进行有益的尝试.

1材料和方法

1.1材料B16小鼠恶性黑色素瘤细胞系、含有鼠GMCSF基因的真核表达质粒pGEMTeasymGMCSF和E.coli JM109为本室保存. 质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司；RNA提取试剂盒、RNA

逆转录试剂盒均为美国Promega公司产品；限制性内切酶、AMV逆转录酶、随机引物均为宝生物公司产品；透析胎牛血清、DMEM培养基、G418,脂质体转染试剂盒均为Gibco公司产品；6～8周龄雄性Balb/c 小鼠购自军事医学科学院实验动物中心.

1.2方法根据mGMCSF序列及pcDNA3.1多克隆酶切位点设计引物，上游: 5′GCTAGCACCATGTAACTGCAGAATTTAC3′,下游5′CTCGAGCTCATT

TTTGGACTGGTTTTT3′. 引物由上海博亚生物工程有限公司合成. 以pGEMTeasymGMCSF质粒为模板,上述mGMCSF基因特异引物按常规方法进行PCR扩增. 将PCR反应产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析. 通过Nucleotrap kit (Clontech)回收阳性PCR产物. 将回收的mGMCSF 基因及pcDNA3.1分别用以NheI和EcoRI双酶切,并用T4 DNA连接酶连接后，转化E.coli JM109, 获得重组质粒pcDNA3.1/mGMCSF. 将限制内切酶进行酶切鉴定正确的菌种送上海生工生物技术公司测定DNA 序列进行确证.

采用Lipofectin 试剂转染，按其说明书进行转染，同时转染pcDNA3.1空载体作为对照. 挑选阳性克隆进行扩大培养，加压筛选2 mo后进行RTPCR鉴定细胞转染结果. 用Promega 公司RNA提取试剂盒提取、纯化细胞总RNA，进行总RNA纯度分析后，按试剂盒说明进行反转录反应，取反转录的cDNA链为模板进行PCR反应. PCR扩增条件为： 95