小RNA和表观遗传修饰

小RNA和表观遗传修饰
东北师范大学细胞与遗传研究所06级研究生
摘要：
小RNA是广泛存在于生物体中的一类主要起调控基因表达作用而非指导蛋白质合成的RNA。

siRNA和microRNA是小RNA中重要的两种，而且发挥着各自不可替代的功能。

二者都能抑制mRNA的表达，但作用方式又各有不同，siRNA主要以RNAi（RNA interference）的方式导致基因沉默；microRNA却在细胞增殖，分化等活动中发挥关键的调控作用。

本文详细介绍了siRNA和microRNA的生物合成，siRNA和microRNA所介导的基因沉默机制，以及siRNA在酵母，植物，人体内通过引发表观遗传修饰的变化调节基因表达的机制模型，最后讨论了siRNA和microRNA对于在疾病治疗和药物研发方面的影响。

关键词：
RNAi siRNA microRNA表观遗传修饰
前言：
在真核生物中，核小体组蛋白的修饰是改变染色质结构，调节基因转录的重要机制，各种组蛋白的修饰作为表观遗传信息被特定的激活因子和抑制因子所识别，在未改变DNA 序列的情况下使表型发生了改变，形成了所谓的组蛋白密码。

已有文献表明：组蛋白H3的N末端9位Lys的甲基化对于抑制染色质的转录活性起到关键作用（1，2，3，4）。

相反，在酵母，线虫，果蝇和哺乳动物中组蛋白H3的9位Lys的甲基化也普遍存在于活跃转录基因的染色质上（4，5，6，7，8）。

与H3K9Me相对应，在植物及某些菌类中也在DNA上存在5-甲基胞嘧啶，从而更加抑制了基因转录。

真核生物的染色质包括常染色质和异染色质。

异染色质上常伴有组蛋白低乙酰化以及高含量的H3K9Me的特征，而且在植物和哺乳动物的异染色质上DNA常为高甲基化状态（1，9，10）。

而且，组蛋白H3的甲基化对于异染色质上一些保守蛋白的结合是必要的。

例如：异染色质蛋白1即HP1（11，12）。

尽管关于异染色质形成的一些通路已经被集中的研究，这一过程的起始步骤目前仍然很模糊。

而如今，特异的非编码RNA分子被认为在诱导异染色质的形成过程中起到关键的作用（13，14，15）。

特别是dsRNA，也叫“short RNA”对于染色质活性的抑制是一个RNA分子参与表观遗传调控的很好的例子。

在基因表达调控的小分子RNA中，siRNA和microRNA是存在于哺乳动物和植物中的很重要的一类小RNA，它们也是近期受到广泛关注的重要的小分子RNA。

其中，microRNA （miRNA）长度约21－25nt，来源于内源的发夹结构RNA，经常靶定于与其序列相似但不完全相同的基因上，行使转录抑制的作用。

而siRNA通常来源于外源的长在的双链RNA或内源的dsRNA，通常靶定于同源序列上，通过RNAi的方式起作用，人们已经发现，microRNA 和siRNA都能够抑制mRNA的翻译而且能够使mRNA降解。

目前已经被公认：microRNA 对于植物动物的生长发育起到重要的调控作用，相对应的，siRNA主要在抗病毒和RNAi 介导的转录抑制方面起关键作用，这些都表明这类RNA在基因表达调控上起到广泛和重要的作用。

而随着对microRNA研究的深入，动物和植物的microRNA数据库也在不断的建立和完善中，/Software/Rfam/mirna，搜集了大部分的关于动植物的microRNA信息。

同时，针对人的siRNA的数据库近期也被发布，，和http://siRNA.cgb.ki.se，这两个数据库包括了已经有
试验证实的数百个人的siRNAd的信息和上千的人为设计并储存的siRNA数据信息。

相信在不久的将来microRNA和siRNA有望对人类疾病的研究产生重大的影响。

本文详细介绍了microRNA和siRNA的生物合成机制，dsRNA介导的基因沉默机制，在微生物，植物，动物中小RNA介导的表观遗传修饰和异染色质形成模型，以及microRNA和siRNA在疾病和药物研究中的一些应用。

1 小分子RNA的生物合成
1．1 miRNA的生物合成
miRNA的生物合成机制近期被阐明是主要由RNA聚合酶Ⅱ转录产生的。

转录启始产物是一个很大的RNA前体，被称为pri-miRNAs。

然后在细胞核内：pri-miRNA被RNaseⅢ，Drosha，双链RNA蛋白以及Pasha（也称为DGCR8）经剪切修饰而形成约70核苷酸的pre-miRNAs，它折叠成非规则的发夹结构。

接下来约70核苷酸的pre-miRNA经由RAN GTP 依赖的Exportin5运出细胞核，在细胞质中受到属于另一类RNaseⅢ的Dicer的进一步的剪切加工，形成长约22个核苷酸的成熟双链miRNA。

成熟的miRNA与miRISC复合物结合行使转录调控的作用。

Drosha存在于细胞核内，至少由两部分组成，其中较大的复合物包括：一系列的RNA 相关蛋白，如RNA解旋酶，与RNA双链结合的蛋白，新型的各种核糖核蛋白以及Ewings sarcoma家族蛋白（16）。

而其中较小的复合物包括：Drasha，双链结合蛋白，DGCR8（也被称为Drasha）等（16，17，18，19，）。

1．2 siRNA的生物合成
siRNA的生物合成来源于Dicer对于双链RNA前体的剪切，而不需要Drasha（20，21）。

双链RNA前体既可以来源于体内，也可以来源于体外。

在体内，可以通过正义链，反义链双向转录合成；外源方面，可能来源于RNA病毒的侵染，如植物，或人为转入外源的RNAi干涉片断，通过与内源RNA配对可以导致内源RNA的降解。

2dsRNA介导的基因沉默机制
1998年，通过dsRNA分子被注入线虫发现它能够有效的抑制与其同源的基因的表达，这些现象被命名为RNA干涉即RNAi（22）。

而后，同样在植物，真菌，原生动物内发现这一现象（23，24，25）。

但是，RNA干涉的分子机制是主要在果蝇细胞提取物（26，27，28，29，30）以及哺乳动物细胞中被揭示的。

2．1siRNA介导的基因沉默机制
siRNA介导的基因沉默机制具体如下：长链dsRNA被RNaseⅢDicer家族的核酸酶剪切成长度为20—25个核苷酸的短的dsRNA。

这种短的干涉RNA即所谓的siRNA。

它在链的两端分别有暴露突出出来的3'-OH，以及被磷酸化的5'末端。

然后，siRNA的一条链与RNA诱导的沉默复合物RISC发生作用，在RISC的作用下，这条链与和它同源的mRNA配对结合。

RISC能够剪切mRNA上特定的被siRNA靶定结合的序列，从而导致mRNA发生降解。

但是如果在siRNA与mRNA不完全配对的情况下，mRNA不能被剪切，但是mRNA与核糖体结合后，翻译过程受到了阻滞，siRNA如何直接导致mRNA的翻译阻滞这一过程的机制目前还不明确。

RISC的核心组成成分是Argonaute（AGO）家族的蛋白，它包含2个结构域PAZ和PIWI。

PAZ结构域能特异的结合 siRNA而PIWI与RnaseH结构域相似能够剪切mRNA。

已有报道：真核生物中如果编码Argonaute家族蛋白的基因突变，那么dsRNA依赖的基因沉默受到阻滞。

2．2 miRNA介导的基因沉默
小RNA的一个来源是siRNA，而另一个不同的来源是所谓的miroRNA，它同样能够抑制
基因的表达。

这类小RNA是来源于核酶Dcier剪切动物和植物基因组编码的发夹结构RNA 前体。

虽然来源与siRNA不同，但是对于mRNA的调节与siRNA很相似，它通常结合于mRNA 的3'-UTR区的互补序列上，当miroRNA于mRNA完全互补结合的情况下阻滞mRNA的翻译（31，32）。

miRNA干涉的具体机制如下：相对应siRNA的第一种机制，当miRNA完全或几乎完全与编码蛋白的mRNA相匹配时，mRNA被miRISC降解，这一过程主要在植物较常见并且与siRNA 的沉默机制很相似，而且在哺乳动物中也被证明有此机制存在。

但是在哺乳动物中，miRNA 主要以第二种机制的方式起作用，此种方式作用如下：miRNA对靶mRNA的调节所用主要通过结合于靶mRNA的3'UTR区即3'非翻译区，而这种调节主要在于转录后尤其是翻译水平的调节。

这种作用机制包含的RISC与siRNA的RNAi的RISC很相似，甚至几乎相同。

miRNA 的这种调节方式导致被调节的基因的mRNA水平几乎没有变化，但蛋白水平明显下降。

在哺乳动物中，miRNA靶定mRNA序列需要FMRP，而且FMRP被casein kinaseⅡ磷酸化（33，34）。

另外，除了以上所提到的mRNA在细胞质中的转录后调节之外，在细胞核内，siRNA也可以抑制同源基因的转录，而且导致染色质结构发生局部变化。

已有报道：在裂殖酵母（S。

prombe），植物，人的细胞中：一些活跃的转录表达的基因上，人为地加入与之相应的siRNA 可以抑制这些基因的转录，并且导致组蛋白H3K9Me的升高（35，36，37）。

在哺乳动物和植物中，siRNA在转录抑制作用的同时也相应的诱导了同源区域上的DNA甲基化。

所以，siRNA可以诱导染色质构象发生变化，从而抑制染色质的转录活性。

目前，内源dsRNA分子在异染色质形成上的研究主要在裂殖酵母S.pombe和植物中得到证实（38，36）.
在包含小RNA的不同复合物中：包括降解mRNA的RISC复合物或使染色质发生集缩的复合物，这二者都含有Agonaute family的蛋白。

而且，Agonaute家族的蛋白在复合物行使功能上起到关键作用。

如果使编码这一家族蛋白的基因发生突变，则dsRNA依赖的 mRNA 降解不能完成（39），microRNA的抑制作用也就消失了（31，39）。

3 小分子RNA与异染色质的的形成
3．1 酵母中小RNA与异染色质的形成模型
有文献报道的siRNA相关的组蛋白修饰是在裂殖酵母S.prombe的异染色质的着丝粒区研究的（38）。

染色质的着丝粒区富含H3K9Me和Swi6蛋白。

Swi6蛋白是一种存在于酵母中的属于多细胞的HP1蛋白（染色质蛋白1）(40).染色质着丝粒处含有很多重复序列，这一区域通常被认为转录不活跃区域。

而dsRAN一方面就是由这里的DNA重复序列经DNA双链的转录生成；另一方面，dsRNA也能通过以单链RNA为模板在RNA指导的RNA聚合酶（RdRp）合成（38）.然后dsRNA经有Dicer剪切为siRNA。

siRNA一方面于RISC（RNA诱导的沉默复合物）相结合，在AGO家族蛋白的作用下，将能与之完全匹配的mRNA在完全匹配的区域将mRNA切断导致mRNA的降解。

另一方面：siRNA能与RITS复合物（RNA诱导的沉默启始复合物）结合。

RITS复合物包含以下组分：Agonaute功能如前面所述，TAS3功能目前尚还不清楚，Chp1蛋白，它包含一个很保守的染色质结合结构域，从而使RITS这一复合物稳定地结合于着丝粒处的重复序列上，而至于siRNA在RIST复合物上如何特异地去识别相应的靶点目前仍然未知。

推测可能是siRNA与同源的DNA之间形成了RNA－DNA杂合物。

RdRp可能相应的放大了沉默作用，也就是放大了siRNA在着丝粒处的转录，对此所作的解释主要有两种机制：第一，RdRp可以以单链的siRNA作为引物合成dsRNA,第二，通过检测人们发现，RdRp在复合物上通过放大着丝粒重复序列的原位RNA，来抑制染色质的活性。

（37，38，41）
RITS复合物招募组蛋白甲基转移酶，从而导致H3K9的甲基化，甲基化修饰导致Swi6蛋白的结合，接下来，基因的转录受到抑制。

Swi6蛋白存在于着丝粒的重复序列上，它对于染色质聚缩是必须的。

Chosion是一个
保守的蛋白，在有丝分裂中对于着丝粒的分开是必要的。

沉默系统蛋白中（包括：AGO,Dicer,RdRp,Swi6以及HMT）任何一个突变缺失都会将细胞的有丝分裂阻滞在后期（42，43）。

因此，小RNA在染色质聚缩，以及酵母正常有丝分裂上起至关重要的作用。

同时也有报道，小RNA对于和减数分裂相关的基因的沉默也有作用。

图1，酵母中小RNA相关的异染色质形成模式图
3．2 植物中小RNA与异染色质形成模型
3．2．1植物中RNA沉默的特点
文献表明，在酵母中RNAi相关基因的突变或失调并未导致异染色质构象的变化，但是却使异染色质上基因的表达抑制作用丢失（44）。

所以在酵母中对于组蛋白甲基转移酶和RNAi的关系再没有深入的探讨。

但是植物中却与酵母的情况不同，植物中对于基因表达的沉默不是基于使组蛋白甲基化，而是使DNA甲基化，这一过程被称为RNA依赖的DNA甲基化。

文献表明：人为的转入与目的基因的启动子同源的dsRNA可使基因甲基化水平升高，从而抑制了该基因的转录（45）。

Dicer，Agronaute,RdRp的缺失突变至少都能造成DNA甲基化不足（36）。

目前，仅有一篇文献报道，在植物中microRNA可以促进DNA甲基化（46）。

植物中存在两类siRNA：长度为21－22个核苷酸片段的短的siRNA和长度为24－26个核苷酸片段的长的siRNA。

它们分别由Dicer2和Dicer3编码。

前者的作用主要是与RISC 复合物结合，从而导致mRNA的降解。

而后者的作用主要是使DNA甲基化从而使染色质活性受到抑制。

3．2．2植物DNA甲基化与RNAi机制模型
在植物中，非RNA依赖的DNA甲基化要比RNA依赖的甲基化更广泛存在（47）。

但是，
RNA依赖的DNA甲基化却对植物的抗病毒特性和自身调控有至关重要的作用。

植物中，RNA 依赖的DNA甲基化机制如下：长分子的dsRNA可能来源于两个途径：一种可以由外界入侵的RNA病毒经过激活细内的RdRp（RNA指导的RNA聚合酶），指导合成dsRNA，另一种也可以由内源的DNA经双向转录作用产生。

dsRNA经Dicer2剪切可形成长度为21－23bp的siRNA片段，它可以与RISC复合物结合，从而导致mRNA的降解; dsRNA经Dicer3剪切可以形成长度为24－26bp的siRNA片段，它也可与另一个蛋白复合物结合，这一蛋白复合物与酵母中的RITS复合物相似，也同样含有Agronaute家族蛋白。

这一蛋白复合物能与染色质相互作用，并且能够招募含有从头合成（de nove）甲基化酶能力的DNA甲基化酶，从而使DNA甲基化：DRM1/DRM2能特异地甲基化CNG或CNN位点；MET1/DRM1/DRM2 特异地甲基化CG位点（48，49）。

ATP依赖的核小体重塑复合物也参与其中，使核小体的构象发生改变并使之与DNA分离，使DNA更容易受到甲基化修饰，从而促进了这一过程的发生。

甲基化了的DNA被含有甲基化DNA结合结构域（MBD）的蛋白识别。

这种蛋白可以招募HDAC和HMT（36）。

HDAC 使H3的9位K乙酰化，HMT再使H3的9位K甲基化，从而使H3K9Ac—H3K9Me. H3K9Me可以被CMT3识别，CMT3即chromodomain of the DNA methylase 并与DRM1/DRM2一起维持CNN和CNG位点的甲基化状态。

而MET1保持着CG位点的甲基化。

如果将编码DNA甲基化酶MET1和蛋白DRM1的基因突变，将导致各种沉默系统中siRNA的缺失（47）。

人们可能会推出这样的结论：siRNA的生成不仅导致了DNA的甲基化，而且DNA甲基化又促进了siRNA的进一步生成，这也意味着染色质集缩区某些位点的高甲基化促进了siRNA的生成。

图2，植物中小RNA相关的异染色质形成模式图
3．3哺乳动物中小RNA与表观修饰模型
尽管以上已经提到dsRNA在植物中能够介导DNA甲基化并且在酵母中能够介导组蛋白修饰。

但是直到近期人们才发现哺乳动物中存在这一现象，最近已有报道证明siRNA可以靶定于不同的基因，尤其是基因的启动子部分通过使DNA甲基化来介导基因转录沉默（50）。

但是对于DNA甲基化在siRNA介导的基因沉默中的作用目前尚存在争议。

有研究表明在siRNA介导的TGS（TGS即transcriptional gene silencing）中，基因启动子处存在DNA甲基化的升高（51）。

而另一部分研究表明siRNA介导的TGS是与组蛋白甲基化升高相关的（52）。

通过人工合成的siRNA已经被证明siRNA是主要在细胞核中通过靶定于特定基因的启动子上导致沉默的发生（53）。

但是同样也有报道存在另一种机制，靶定于启动子的siRNA 是被转运入核的，而且tRNA vector-based siRNA起初主要是定位于细胞质中的，但却有效的靶定癌基因erbB2启动子并且诱导了CpG岛特异的甲基化（54）。

这一过程同样如同在酵母和植物中一样，需要一个Arognaute相关的复合物。

尽管如此，siRNA是如何被导向并且能够靶定在人类细胞的基因组DNA上，目前还尚不明确。

已有文献表明：与植物中相似，一小部分siRNA相关的复合物蛋白可能是被运送入核的（55，56）。

但也有另一种可能性，siRNA也可能在细胞分裂过程中当核膜消失时靶定于基因的基因组DNA上。

而且，目前还仍然不知道在人类细胞中，siRNA介导的TGS是通过siRNA靶定于mRNA的RNA/RNA 相互作用模式还是通过siRNA直接靶定于启动子的RNA/DNA相互作用模式起作用。

目前已知的siRNA介导的TGS在人类细胞中被证实DNMT-3b也参与了DNA甲基化，另外DNMT－3a也在近期被发现与siRNA靶定的启动子的一条链共定位而且也参与到此机制中，RNApolⅡ和组蛋白甲基化酶也存在于此机制中。

RNA/RNA model
Me
RNA/DNA model
图3，siRNA靶定在启动子处的RNA/RNA模式和RNA/DNA模式
在基因沉默过程中，DNA的甲基化和组蛋白的修饰实质上是协同作用的。

DNA甲基化酶DNMT3a和DNMT3b与组蛋白去乙酰化酶相互作用发生于它们的A TRX结构域(57).DNMT3a可能不仅以从头合成型甲基化酶的活性起作用，而且还可能在复合物中起到招募和关联组蛋白去乙酰化酶和甲基化酶的作用。

有趣的是siRNA介导的TGS在人类细胞中不仅能诱导靶基因的沉默，而且也能导致H3K9甲基化（54），H3的Lys的甲基化发生于K4,9,27和36（58）。

而且经5－AzaC和TSA处理的人类细胞恰恰可以使siRNA介导的TGS
发生逆转（52），这表明组蛋白和DNA修饰在siRNA介导的TGS中的重要作用。

在哺乳动物中，H3K9位甲基化由Suv39H1指导合成(59).H3K9位甲基化直接招募了Swi6/HP1,而这种招募又致使H3K9位甲基化作用在cis区被放大（60），HP1的染色质结合结构域识别甲基化了的H3K9（61），在人类细胞中HP1通过组蛋白尾部的Lys的甲基化与HDAC相互作用介导了转录抑制（62），也就是说HDAC将H3K9位的乙酰基团移出从而使H3K9位甲基化，甲基化的H3K9促进了与HP1的相互作用，HP1招募许多转录抑制因子形成了一个表观遗传信号，最终导致了所在基因的表达调节。

总结人类中，siRNA介导的TGS与表观遗传修饰的可能模型步骤如下：
1 首先siRNA与一个已经招募含有DNMT3a的复合物结合（63），DNMT3b也可能被包含在此复合物中（64）。

2 所得的复合物经siRNA通过两种模式：RNA/RNA相互作用模式或RNA/DNA相互作用模式识别并靶定在目的基因的启动子区域。

3 包含有DNMT3a和siRNA的复合物可能招募HDAC1和Suv39H1(65，66)。

4 从而导致了H3K9位去乙酰化和甲基化，也可能包含H3K27，H3K9（或者还有H3K27）位的甲基化抑制了基因的表达。

最后，经过抑制因子和其他机制的作用DNA甲基化从而永久地维持siRNA靶定的基因。

而有趣的是，NuRD染色质重塑复合物与HDAC1，DNMT3a, siRNA又彼此相关。

目前已经有6种可以确定的成分：核小体重塑复合物Mi2/NuRD，retinoblastoma(Rb)，HDAC1和2，组蛋白甲基转移酶（Suv39H1）和HP1。

图4，人类细胞中siRNA介导的表观修饰模式图
图5，小RNA的合成和调控网络图
（黑色箭头表示合成线路，红色箭头表示调控线路）
4 microRNA和RNAi在疾病治疗方面的应用
4．1 microRNA和细胞分化
越来越多的证据已经表明，miRNA在不同组织和不同的细胞中，以及在分化的不同阶段表达都有所不同。

已有报道，本来在脑组织中表达量很高的miRNA－124在HeLa细胞中使基因受到调节从而使HeLa向脑组织方向发生分化，而过量表达本来在肌肉组织中大量存在的miR－1致使HeLa向肌肉方向发生分化(67)。

这一结果表明：miRNA对于细胞分化起很重要的作用。

近期文献表明：miRNA在哺乳动物造血系统的分化中也起到关键作用。

例如，miRNA－181是在鼠胸腺和B淋巴细胞中优先表达，在造血干细胞中促进B细胞分化。

相反地，过量表达miRNA－181家族中的miRNA－181a被证明抑制人类中成巨核细胞分化（68）。

4．2 microRNA和癌症
目前已被承认，microRNA表达变化能诱发和促进癌症的发生。

大于50％的microRNA存在于癌症相关的基因组区域中（69）。

在慢性B淋巴细胞白血病（B-CLL）中microRNA－15a和microRNA－16都是缺失或者大量的低表达（约68％）（70）。

这两种
microRNA都能下调B细胞淋巴瘤2（Bcl2）,这种蛋白在多种癌症中都有表达并且对细胞致死。

而过量表达miRNA－15和miRNA－16在MEG－01细胞系中能够诱导细胞凋亡，相对应地，microRNA的一个簇miRNA17－92多顺反子被发现在象B-CLL这样的癌症中高表达（71），这一个簇中的6个microRNA都被c-myc上调，它们的表达是人类癌细胞中最常见的异常现象之一，而这一簇中的microRNA17－5p和microRNA－20a下调转录因子E2F1的表达（72）。

这些结果都表明了microRNA不仅在临床治疗上而且在诊断上都有很大的潜力。

4．3 microRNA和药物研究
microRNA能够在药物研究中引起共同的关注总结起来主要有以下几点原因：第一，除了在癌症的早期发生和扩散过程中的作用之外，microRNA也在细胞分化，凋亡，糖尿病，甲型肝炎等生物信号通路中起到关键作用，许多疾病也都是由于microRNA的异常表达导致的。

比如上文提到的microRNA－15和microRNA－16在绝大多数B-CLL中都是不表达或低表达的，所以它们被认为起到抑癌作用。

第二，某些microRNA表达量的变化直接反映出肿瘤的恶性程度，因此在诊断过程中可以作为标靶。

第三，microRNA能够被用于基因治疗，可以通过病毒质粒或化学修饰的手段把有作用的microRNA导入体内。

随着技术的不断进步，microRNA已经有了很多的突破，相信不久就会有microRNA相关的药物成功问世。

4．4 RNAi在治疗方面的应用
RNAi具有如下重要特征：(1)RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默机制；(2)RNAi 的特异性；(3)RNAi的高效性；(4)RNAi的高穿透性。

RNAi体内外的研究已显示了RNAi 在癌症治疗方面良好的应用前景，多种癌基因可以作为靶点，设计相对应的siRNA引发RNAi，使癌基因或突变基因沉默关闭。

利用RNAi技术提高肿瘤对放射线或药物的敏感性则是RNAi技术应用于肿瘤治疗的另一思路。

针对肝炎病毒的siRNA能有效抑制HBV、HCV 的RNA分子转录和病毒复制，最终降低病毒抗原表达，为运用RNAi技术进行抗病毒性肝炎基因治疗提供了新的思路。

在最近的一系列研究中，人们应用siRNA相继成功地在哺乳细胞内阻止了人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染。

此外，RNAi还具有抑制脊髓灰质炎病毒感染和抗SARS病毒的作用。

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