蛋白质工程概述
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盒式诱变 PCR诱变
核苷酸引物诱变
以化学合成的含有突变核苷酸的核苷酸短 片段为引物，对单链DNA分子进行复制， 随后这段寡核苷酸引物便成了新合成的 DNA子链的一个组成部分，新链便具有已 发生突变的核苷酸序列。
盒式诱变
1985年Wells提出的一种基因修饰技术，一 次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸 的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基 酸进行“饱和性”分析。
(3)将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志 进行筛选和测序。 （4）融合基因的诱导表达及蛋白质的纯化。
融合蛋白的应用：
靶向药物：（药物和可以与病灶特异结合的配基） 将这两者融合，构成融合蛋白，它可以特异性地 与靶细胞或治病因子结合，并把药物引导至病灶， 提高药效。
构建多功能新细胞因子：利用基因融合技术创造 出自然界原本不存在的活性更佳的细胞因子
改善药物半衰期（采用融合蛋白技术可直接操作 分子大小的方法是蛋白质自身共价结合）：抗血 栓的水蛭素（40倍）
其他
➢ 2、水蛭素改造 ➢ 3、生长激素改造 ➢ 4、胰岛素改造 ➢ 5、致癌酶的改造 ➢ 6、金属硫蛋白的改造 ➢ 7、人白细胞介素-2的改造 ➢ 8、组织纤溶酶原激活因子的改造 ➢ 9、枯草杆菌蛋白酶的改造
蛋白质工程4大类研究： ➢ 1、利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。 ➢ 2、定量确定蛋白质结构-功能关系。包括蛋白质三维结构
模型的建立，酶催化性质、蛋白质折叠和稳定性研究、蛋 白质变异的探讨等。 ➢ 3、从混杂变异体库中筛选出具有特定结构-功能关系的蛋 白质。 ➢ 4、根据已知结构-功能关系的蛋白质，用人工方法合成它 及其变异体，完全人为控制蛋白质的性质。
生物技术制药 Biotechnological Pharmaceutics
第三课 基因工程制药
基因
氨基酸序列
蛋白质
DNA mRNA 多肽链 转录 翻译
三维结构 折叠
预期功能 生物功能
三、蛋白质工程的基本步骤
分离提纯目标蛋白 对目的蛋白进行氨基酸测序 借助核磁共振、生物质谱获得蛋白质的二级和三
级结构 设计编码蛋白质的基因改造方案 对基因序列进行改造，并将经过改造的基因片段
采用基因重组技术获取该目的基因，表达新蛋白 产物 分离提纯新蛋白并对功能监测后投入应用
基因工程与蛋白质工程的区别：
基因工程通过分离目的基因重组DNA分子，使目的 基因更换宿主得以异体表达，从而创造新类型， 但这只能合成自然界固有的蛋白质。
蛋白质工程则是运用基因工程的DNA重组技术，将 克隆后的基因编码序列加以改造，或者人工合成 新的基因，再将上述基因通过载体引入适宜的宿 主系统内加以表达，从而产生数量几乎不受限制、 有特定性能的“突变型”蛋白质分子，甚至全新 的蛋白质分子。
完整基因
连接酶
百度文库
调节基因 启动基因
结构基因
融合蛋白技术的内容
（1）进行目的基因的克隆，根据基因测序列互补 原则，设计合理的引物序列，以cDNA为模版，利 用PCR技术扩增不同的目的基因的DNA片段；
（2）在载体中进行重组，通过限制性内切酶将两 个DNA片段进行酶切并回收，通过连接酶将两个 具有相同末端酶切点的基因片段进行体外连接， 并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。
利用目的基因序列中的适当限制性内切性 酶酶切位点，插入各种合适的突变DNA片 段，用以取代目标基因中特定的DNA片段。
同时获得酶多切割个突变体
蛋白基因
新突变质粒
核苷酸片段
PCR诱变
双链DNA变性
94 oC，1 min
退火，引物结合
54 oC，45 s
链延伸
72 oC，2 min
生物技术制药
蛋白质改造常用方法
生物技术制药
理性方法
定位突变 区域性定向突变 从头设计
非理性方法 随机广泛突变 分子重排
生物技术制药
（一）定点突变改进蛋白质
基因人工定点突变是通过取代、插入或缺失 基因DNA序列中任一特定的核苷酸序列来 改造蛋白质的方法。
前提：已知蛋白质分子的结构和功能 分为三类：核苷酸引物诱变
生物技术制药
第三章 蛋白质工程概述
蛋白质工程
生物技术制药
蛋白质工程的目的是以蛋白质的结构-功能研 究为基础，运用基因工程技术定向改造天然 蛋白质，或设计创造全新蛋白质；
蛋白质工程常被称为第二代基因工程；
1982年：通过定点突变获得改性酪氨酸tRNA 合成酶；
1983年：Science发表以“Protein engineering”为题的专论。
蛋白质工程的重要意义
为蛋白质结构-功能关系研究提供强有力的而且是 不可替代的手段。
研制活性高、稳定性好和毒副作用小的新型蛋白 类药物，以及新型的抗生素、定向免疫毒素和工 程抗体。
构建具有独特的催化和分子识别功能的酶制剂和 生物传感器。
改变或改良农作物的品质，设计生产新型生物杀 虫剂。
二、蛋白质工程的研究内容
蛋白质工程技术在新药研究中应用：
提高药效活性（TNF杀伤肿瘤细胞） 提高靶向性（作用于特定组织或细胞） 降低蛋白质类药物引起的免疫反应（人源化重组
蛋白） 获得具有新功能的蛋白质分子（不同功能的部分
重组） 其他（提高药物稳定性、改善药代动力学特性、
使之易于生产纯化，减低成本）
DNA合成
分子设计
蛋白质工程药物发展三个阶段：
第一阶段：未经修饰的天然蛋白质被开发 的药物（胰岛素、促红细胞生成素、干扰 素）
第二阶段：在第一代基础上加以简单工程 技术修饰（促红细胞生成素、干扰素）
第三阶段：优化药物的生物学活性和理化 性质（一级结构的处理、化学修饰、蛋白 质翻译后的修饰及融合蛋白的应用）
生物技术制药
依赖高保真 DNA高温聚 合酶的PCR 直接点突变
（二）采用融合蛋白技术改进蛋白 质
概念：是由一条短的原核多肽和真核蛋白 结合在一起所形成的蛋白质，其氨基端是 原核序列，羧基端是真核序列。
原则：将一个蛋白质基因序列的终止密码 子删除，在接上带有密码子的第二个蛋白 质基因，可实现2个基因的融合表达。
核苷酸引物诱变
以化学合成的含有突变核苷酸的核苷酸短 片段为引物，对单链DNA分子进行复制， 随后这段寡核苷酸引物便成了新合成的 DNA子链的一个组成部分，新链便具有已 发生突变的核苷酸序列。
盒式诱变
1985年Wells提出的一种基因修饰技术，一 次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸 的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基 酸进行“饱和性”分析。
(3)将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志 进行筛选和测序。 （4）融合基因的诱导表达及蛋白质的纯化。
融合蛋白的应用：
靶向药物：（药物和可以与病灶特异结合的配基） 将这两者融合，构成融合蛋白，它可以特异性地 与靶细胞或治病因子结合，并把药物引导至病灶， 提高药效。
构建多功能新细胞因子：利用基因融合技术创造 出自然界原本不存在的活性更佳的细胞因子
改善药物半衰期（采用融合蛋白技术可直接操作 分子大小的方法是蛋白质自身共价结合）：抗血 栓的水蛭素（40倍）
其他
➢ 2、水蛭素改造 ➢ 3、生长激素改造 ➢ 4、胰岛素改造 ➢ 5、致癌酶的改造 ➢ 6、金属硫蛋白的改造 ➢ 7、人白细胞介素-2的改造 ➢ 8、组织纤溶酶原激活因子的改造 ➢ 9、枯草杆菌蛋白酶的改造
蛋白质工程4大类研究： ➢ 1、利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。 ➢ 2、定量确定蛋白质结构-功能关系。包括蛋白质三维结构
模型的建立，酶催化性质、蛋白质折叠和稳定性研究、蛋 白质变异的探讨等。 ➢ 3、从混杂变异体库中筛选出具有特定结构-功能关系的蛋 白质。 ➢ 4、根据已知结构-功能关系的蛋白质，用人工方法合成它 及其变异体，完全人为控制蛋白质的性质。
生物技术制药 Biotechnological Pharmaceutics
第三课 基因工程制药
基因
氨基酸序列
蛋白质
DNA mRNA 多肽链 转录 翻译
三维结构 折叠
预期功能 生物功能
三、蛋白质工程的基本步骤
分离提纯目标蛋白 对目的蛋白进行氨基酸测序 借助核磁共振、生物质谱获得蛋白质的二级和三
级结构 设计编码蛋白质的基因改造方案 对基因序列进行改造，并将经过改造的基因片段
采用基因重组技术获取该目的基因，表达新蛋白 产物 分离提纯新蛋白并对功能监测后投入应用
基因工程与蛋白质工程的区别：
基因工程通过分离目的基因重组DNA分子，使目的 基因更换宿主得以异体表达，从而创造新类型， 但这只能合成自然界固有的蛋白质。
蛋白质工程则是运用基因工程的DNA重组技术，将 克隆后的基因编码序列加以改造，或者人工合成 新的基因，再将上述基因通过载体引入适宜的宿 主系统内加以表达，从而产生数量几乎不受限制、 有特定性能的“突变型”蛋白质分子，甚至全新 的蛋白质分子。
完整基因
连接酶
百度文库
调节基因 启动基因
结构基因
融合蛋白技术的内容
（1）进行目的基因的克隆，根据基因测序列互补 原则，设计合理的引物序列，以cDNA为模版，利 用PCR技术扩增不同的目的基因的DNA片段；
（2）在载体中进行重组，通过限制性内切酶将两 个DNA片段进行酶切并回收，通过连接酶将两个 具有相同末端酶切点的基因片段进行体外连接， 并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。
利用目的基因序列中的适当限制性内切性 酶酶切位点，插入各种合适的突变DNA片 段，用以取代目标基因中特定的DNA片段。
同时获得酶多切割个突变体
蛋白基因
新突变质粒
核苷酸片段
PCR诱变
双链DNA变性
94 oC，1 min
退火，引物结合
54 oC，45 s
链延伸
72 oC，2 min
生物技术制药
蛋白质改造常用方法
生物技术制药
理性方法
定位突变 区域性定向突变 从头设计
非理性方法 随机广泛突变 分子重排
生物技术制药
（一）定点突变改进蛋白质
基因人工定点突变是通过取代、插入或缺失 基因DNA序列中任一特定的核苷酸序列来 改造蛋白质的方法。
前提：已知蛋白质分子的结构和功能 分为三类：核苷酸引物诱变
生物技术制药
第三章 蛋白质工程概述
蛋白质工程
生物技术制药
蛋白质工程的目的是以蛋白质的结构-功能研 究为基础，运用基因工程技术定向改造天然 蛋白质，或设计创造全新蛋白质；
蛋白质工程常被称为第二代基因工程；
1982年：通过定点突变获得改性酪氨酸tRNA 合成酶；
1983年：Science发表以“Protein engineering”为题的专论。
蛋白质工程的重要意义
为蛋白质结构-功能关系研究提供强有力的而且是 不可替代的手段。
研制活性高、稳定性好和毒副作用小的新型蛋白 类药物，以及新型的抗生素、定向免疫毒素和工 程抗体。
构建具有独特的催化和分子识别功能的酶制剂和 生物传感器。
改变或改良农作物的品质，设计生产新型生物杀 虫剂。
二、蛋白质工程的研究内容
蛋白质工程技术在新药研究中应用：
提高药效活性（TNF杀伤肿瘤细胞） 提高靶向性（作用于特定组织或细胞） 降低蛋白质类药物引起的免疫反应（人源化重组
蛋白） 获得具有新功能的蛋白质分子（不同功能的部分
重组） 其他（提高药物稳定性、改善药代动力学特性、
使之易于生产纯化，减低成本）
DNA合成
分子设计
蛋白质工程药物发展三个阶段：
第一阶段：未经修饰的天然蛋白质被开发 的药物（胰岛素、促红细胞生成素、干扰 素）
第二阶段：在第一代基础上加以简单工程 技术修饰（促红细胞生成素、干扰素）
第三阶段：优化药物的生物学活性和理化 性质（一级结构的处理、化学修饰、蛋白 质翻译后的修饰及融合蛋白的应用）
生物技术制药
依赖高保真 DNA高温聚 合酶的PCR 直接点突变
（二）采用融合蛋白技术改进蛋白 质
概念：是由一条短的原核多肽和真核蛋白 结合在一起所形成的蛋白质，其氨基端是 原核序列，羧基端是真核序列。
原则：将一个蛋白质基因序列的终止密码 子删除，在接上带有密码子的第二个蛋白 质基因，可实现2个基因的融合表达。