小鼠胚胎培养方法的探究

小鼠胚胎培养方法的研究
摘要
目的：探讨小鼠早期胚胎在不同的体外培养液中生长发育的状况，从而寻找胚胎培养的最佳培养体系，为人类胚胎培养方法的改善提供理论依据，以提高临床体外受精一胚胎移植（ＩＶＦ．ＥＴ）的成功率。

方法：配制不同的培养液，对１００例小鼠超排卵共取卵子１６７８枚，分别在不同的培养液中进行体外授精，并将２一细胞鼠胚放入各组培养液中进行培养，其中，血清组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清：卵泡液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加ｌＯ％人卵泡液；蜕膜细胞条件培养液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加ｌＯ％条件培养液：血清加卵泡液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清和５％人卵泡液：血清加条件培养液组为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清和５％条件培养液。

每日在显微镜下观察小鼠胚胎的发育情况，分析受精率、卵
山西医科大掌
裂率、卵裂速度及桑椹胚与囊胚形成率，采用ｘ２分割检验进行统计分析。

结果：
一、１、小鼠胚胎在蜕膜细胞条件培养液中有７２．９％发育到８．细胞期，６６．０％发育到桑椹胚，６１．６％形成囊胚，３２．１％胚胎孵化。

而对照组有４３．６％发育到８．细胞期，３０．９％发育到桑椹胚，１９．１％到初级囊胚，５５％孵化的胚胎。

两组比较有显著性差异。

２、卵泡液的胚胎有７１．３％到８．细胞期，５８８％发育到桑椹胚，５０．Ｏ％形成囊胚，２５７％孵化。

与对照组比较有差显著性异。

３、血清组有５３，４％发育到８．细胞期，４０．５％到桑椹胚，２９．３％形成囊胚，仅有７．８％孵化。

与对照组无显著性差异。

二、鼠卵在不同培养液中受精率无显著性差别，而对于卵裂率和优质胚胎的形成率，鼠卯在蜕膜细胞条件培养液组和卵泡液组中均与对照组有显著性差异，而血清组与对照组比较无差异。

鼠胚在蜕膜细胞条件培养液和卵泡液中培养发育速度快，碎片率明显低于对照者。

三、小鼠早期胚胎在卵泡液组、蜕膜细胞条件培养液组
中的调亡速度明显低于对照组，有显著性差异，而血清组中鼠胚的调亡速度低于对照组，但无显著性差异。

四、小鼠胚胎在血清加卵泡液组中发育到８－ｆｌＩｊ胞划，桑椹胚，囊胚及孵化胚胎的比率分别是７２．７％，６２．３％，５１２％和２８．５％，在血清加条件培养液组中则分别有７４．１％，６８．５％，６２０％和３５．２％发育至８．细胞期，桑椹胚，囊胚和孵化胚胎。

各组与血清组比较均有显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０１）。

结论：早孕蜕膜细胞能释放某些刺激胚胎发育的物质，可以促进胚胎体外发育，并提高胚胎发育质量。

卵泡液对早期胚胎发育有促进作用，早期胚胎培养中，在培养液中添加人卵泡液对提高早期胚胎培养质量有显著的效果。

关键词：胚胎发育条件培养液卵泡液血清
山西医科大掌硕士掌位论文
Ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｔｅｃｈｎｉｑｕｅｏｆ
ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｓｃｕｌｔｕｒｅｉｎｖｉｔｒｏ
●
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｏｎｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｓｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅｎｓｅａｒｃｈｔｈｅｂｅｓｔｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍｏｆｅｍｂｒｙｏｓｉｎｖｉｔｒｏ，ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｔｈｅｏｒｙｔｈａｔｃａｎ
ｏｆｉｍｐｒｏｖｅｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｓｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｔｉｌｅｏｕｔｃｏｍｅｓ
ｉｎｖｉｔｒｏｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ—ｅｍｂｒｙｏｔｒａｎｓｆｅｒ（ＩＶＦ・ＥＴ）
Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａｓａｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，ｈｕｍａｎｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｆｌｕｉｄ（ＨＦＦ），ｓｅｒｌａｍａｎｄｄｅｃｉｄｕａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅａｄｄｅｄｔｏＥａｒｌｅ
ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．１６７８ｎｌｏｕｓｅｏｖｕｍｓｗｅｒｅ
ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ，ａｎｄｔｈｅｎ２－ｃｅｌｌｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｔｈｅｓｅｍｅｄｉｕｍ．Ａｎｄｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅａｂｏｖｅｓｙｓｔｅｍｗｅｒｅｃｌｏｓｅｌｙｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｔｉｌｅｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｒａｔｅ，
ａｎｄｃｌｅａｖａｇｅｒａｔｅａｎｄｓｐｅｅｄ，ｇｏｏｄｅｍｂｒｙｏｒａｔｅ，ｍｏｒｕｌａｒａｔｅ
ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｒａｔｅｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ
山西医科大掌硕士掌位论文Ｒｅｓｕｌｔｓ：
一‘、１、Ａｍｏｎｇｔｈｅｅｍｂｒｙｏｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｄｅｃｉｄｕａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｎｅｄｉｕｍ，ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ７２９％，６６０％，６Ｉ．６％ａｎｄ３２．Ｉ％ｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｏ８－ｃｅｌｌｓｔａｇｅ，ｍｏｒｕｌａｓｔａｇｅ，ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓｔａｇｅａｎｄｈａｔｃｈｉｎｇ，ｔｈｅｒｅａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌ（４３．６％，３０．９％，１９．１％．５．５％．Ｐ＜Ｏ．０１），２、ＨＦＦｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｆｒｏｍｔｈｅ２－ｃｅｌｌｓｔａｇｅｔｏｔｈｅ８－ｃｅｌｌｓｔａｇｅ（７１３％），ｍｏｒｕｌａｓｔａｇｅ（５８．８％），ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓｔａｇｅ（５０．０％）ａｎｄｈａｔｃｈｉｎｇ（２５．７％、ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐ＜０．０１）．３、ｔｈｅｒｅａｒｅｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｂｏｕｔｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｅａｃｈｓｔａｇｅｏｆｅｍｂｒｙｏｓｂｅｔｗｅｅｎｓｅｒｕｍｇｒｏｕｐ（５３．４％，４０．５％，２９．３％，７．８％）ａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐ＞０，０５）
二、Ｔｈｅｒｅａｒｅｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｍｏｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉｕｍａｂｏｕｔｔｉｍｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｒａｔｅ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ａｂｏｕｔｃｌｅａｖａｇｅｒａｔｅａｎｄｇｏｏｄｅｍｂｒｙｏｒａｔｅ，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗｅｒｅｆｏｕｎｄｂｅｔｗｅｅｎＨＦＦａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｒｂｅｔｗｅｅｎｄｅｃｉｄｕａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ，ｂｕｔｔｈｅｒｅａｒｅｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｓｅｒｕｍａｎｄｃｏｎｔ０１．ＥｍｂｒｙｏｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎＨＦＦｇｒｏｕｐａｎｄｄｅｃｉｄｕａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍｇｒｏｕｐｃｌｅａｖｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｆａｓｔｅｒｔｈａｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｓｈｏｗｅｄｎｏｏｒｌｅｓｓ
山西医科大掌硕－＆－学位论文ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ
三、ＨＦＦｇｒｏｕｐａｎｄｄｅｃｉｄｕａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍｇｒｏｕｐｃｏｍｐｍｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒ０１．ｓｉｇｎｉｌｉｃａｎｔｄｉｌｌ’ｅｌｅｎｔｗｅＩ‘ｅＩｂｔｍｄｉｌ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｅｍｂｒｙｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ｏｎｔｈｅｃｏｎｔｒａｒｙ，ｔｈｅｒｅａｒｅｎｏ
ｅｍｂｒｙｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｓｅｒｕｍａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ
四、ＷｈｅｎＨＦＦａｎｄｄｅｃｉｄｕａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍｗａｓａｄｄｅｄｔｏｓｅｒｔｌｌｎｇｒｏｕｐｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｅｍｂｒｙｏｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｓｅｒｕｍｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｒｅｈａｖｅｂｏｔｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｅａｃｈｓｔａｇｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｓｅｇｒｏｕｐａｎｄｓｅｌｑ．１ｍｇｒｏｕｐ（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１）
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｄｅｃｉｄｕａｌｃｅｌｌｃａｎ
ｒｅｌｅａｓｅｓｏｍｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｔｈａｔｃａｎｓｕｐｐｏｒｔｅａｒｌｙｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
ｏｆｅｍｂｒｙｏｓｗｉｔｈｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｙｉｅｌｄａｒｅａｓｏｎａｂｌｅｎｕｍｂｅｒ
ｈｕｍａｎｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｇｏｏｄｑｕａｌｉｔｙｕｐｔｏｔｈｅｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓｔａｇｅ．Ａｎｄ
ｆｌｕｉｄｉｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｉｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｎｌｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｓｉｎｖｉｔｒｏ
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ｍｅｄｍｍｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｆｌｕｉｄｓｅｌｑ．１Ｕｌ
６
山西医科大掌
日ＩＪ吾
不孕症一直以来都是困扰医生和患者的一个难题，医学界对不孕症己进行了多年的探索和研究。

掘ＷＨＯ估计，眦界范围内共有８％．１０％的夫妇存在不孕问题。

自从１９７８年世界上第一例试管婴儿诞生后，至今全球已有数万例试管婴儿诞生，但世界上试管婴儿中心活产率仅有１０％左右，其原因除子宫内膜准备不充分外，另一重要原因是胚胎质量差。

因此受精卵的体外培养就成为生殖医学中一个重要而基础的问题，适宜的培养体系也是动物胚胎生物技术、胚胎分割、胚胎克隆、胚胎嵌合等的基础条件和有效工具。

而且，胚胎发育至桑椹胚或囊胚阶段，胚胎移植妊娠成功率会大大增加。

这就要求，早期胚胎的体外培养多达７ｄ之久。

然而，常规体外培养的胚胎发育率低，胚胎质量差，为解决这一难题，研究者们不断探索改进胚胎体外培养的技术方法。

最早用来研究受精卯体外培养的介质是生理盐水，受精卵很快死亡。

为了更明确地知道受精卵存活发育所需物质及
其代谢及微环境等，研究者们从６０年代起进行了近４０年的研究，主要从两个方面迸行：（１）改良培养液的成分。

（２）利用各种辅助细胞建立联合培养体系。

体外培养需要在合成培养基中补充一定量的生物性体液或组织提取液，如胚胎没澉、ｆｆｎ．消博／｛’能支持；１４ｉ；ｌｆｆ－矧ｌＪ地的化Ｋ增ｍ。

，人类胍胎礼ｆ０统培养液中培养，仅有１５％一２０％的胚胎能发育到囊胚期，大多数胚胎在传统培养液中培养到ｄ５即终止发育。

而在条件培养基中，体外受精率有所提高１１Ｉ，而且具有增强胚胎活力，改善形态结构以及提高着床率和中、晚期妊娠率的作用１２１。

在合成培养基中补充一定量的生物性体液或组织提取液除了提高胚胎卵裂率及囊胚形成率外，还有以下作用：１、可用于胚胎筛选，即随着培养时间的延长，质量好的胚胎继续发育，质量差的胚胎停止发育，为筛选优质胚胎提供了条件：２、有利于显微操作后胚胎的修复；３、为冷冻复苏后的胚胎提供恢复时间；４、改善胚胎质量。

本文在培养液中分爿ＪＪＪＤ入蜕膜细胞条件培养液、卵泡液及血清，以探讨不同培养液对早期鼠胚体外发育的机理。

在过去几十年里，小鼠基础生殖研究为人类生殖医学提
山西医科大掌硕士学位论文供了丰富的理论基础和实践指导，导致了人类相关研究的一系列进展和成就。

本文的目的旨在以小鼠为试验动物模型，分析小同培养液的质量和效果。

从啪．、Ｊ找胚胎培养的山支ｔｊ二培养体系，为人类胚胎培养方法的改善提供理论依据，以提高体外受精一胚胎移植（ＩＶＦ．ＥＴ）的成功率。

但是，直到今天我们对受精卵发育所需物质和生长的微环境的了解还远远不够。

人们对不同培养体系促进受精卵发育的机理仍知之甚少，这些都有待更加深入的研究。

材料与方法
一、实验动物
选用山西医科大学实验动物中心提供的性成熟的昆明白小鼠，其中，雄性４０只，体重３０—４０９，雌性１００只，体重２５－３０９，鼠龄６・８周。

二、主要试剂
１、Ｅａｒｌｅ试剂、胶原酶、透明质酸酶：购自美国Ｓｉｇｍａ公司。

２、人绝经期促性腺激素（ｈＭＧ）和人绒毛膜促性腺激
山西医科大学硕士掌位论文素（ｈＣＧ）：购自丽珠制药有限公司。

３、胰蛋白酶：购自上海第二生化制品公司。

４、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ＳＦ－－１２：购自美国Ｇｉｂｃｏ公司。

三、主要仪器
二氧化碳孵箱（Ｓ１１ｅＪ—ＬａｂＴＣ２３２３，美国）、解剖显微镜（Ｍｏｔｉｃ，日本）、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒置显微镜（ＩＸ７０，日本）、离心机、水浴锅
四、实验方法
１、人卵泡液的采集与处理
在取卵日，选择３５岁以下，月经规律，无免疫及不明原因不孕病史的患者，选直径１８ｍｍ，内含健康成熟卵子的卵泡取卵泡液，放在１０ｍｌ尖底离心管内离心，３０００ｒ／ｍｉｎ，３０ｍｉｎ。

取出上清液，置５６口水浴锅灭活３０ｍｉｎ，０．２ｐｍ滤器过滤除菌。

２、人ｍ清的采集１ｊ处理
ＩＶＦ者注射人绒毛膜促性腺激素（ＨＣＧ）后第２天，早晨空腹抽血１０ｍｌ，置室温２０ｍｉｎ后离心，３０００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ。

吸出上清液，再离心３０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ，取出上清液，于５６
口水浴锅灭活３０ｍｉｎ，直径０．２ｕｍ滤器过滤除菌。

３、人类蜕膜细胞条件培养液的制各
对早孕人工流产健康妇女，于术巾用无菌瓶收集蜕膜标本．置于盛有１００ｕ／ｍｌ青霉素，１００９／ｍｌ链霉素的－４口的Ｄ—ＨａｎｋＳ液中．即刻送至实验室消化培养。

复合消化酶由Ｏ．２５％胰蛋白酶、０．２％透明质酸酶和Ｏ．２％胶原酶按２：ｌ：２的比例（ｖ／ｖ）混合而成。

消化时间３０．４０ｒａｉｎ，消化后细胞接种于ＦＤ液中进行培养，过夜换液清除污染的红细胞和未贴壁成分。

当细胞长至８０％融合时，收集培养上清液，３０００ｒ／ｍｉｎ离心，０．２１ａｍ滤膜过滤，作为条件培养液备用
４、超排卵治疗及卵子的获得和处理：每只雌鼠腹腔内注射人绝经期促性腺激素（Ｉ－ＩＭＧ）１０ＩＵ，４８小时后腹腔内注射绒毛膜促性腺激素（ＨＣＧ）１０ＩＵ，于第二次注射后１４．１９ｈ脱颈椎处死。

无菌操作下迅速取出双侧输卵管，显微镜下观察，撕开膨大部采集卵子，将收集到的卵子置于培养液中，在３７０含５％ＣＯ，的培养箱中２—４ｈ。

培养液提前１６ｈ完成配制，放入３７［３，５％ＣＯ，培养箱中平衡。

５、精子来源及处理：取雄性成年小鼠脱颈椎处死后打
开腹腔，取出附睾，轻压附睾尾部，精子自然流出。

使获得的精子在培养液中于３７口，５％Ｃ０，培养箱内培养２ｈ以上。

６、授精：Ｈ义卵后４—６１１’加入柑子进行授粘培养。

６－８ｈ后取出有２个原核和极体的受精卵移入不同培养液中继续培养。

７、结果观察：每曰取出培养皿用倒置显微镜观察胚胎发育情况并记录拍照。

８、胚胎质量的评估：授精后４０ｈ检查卵裂情况与胚胎质量。

卵裂率是根据受精后卵裂时期ｉ，１ｚ估，胚胎质量根据无核碎片占整个胚胎的比例以及卵裂球大小是否均匀，将胚胎质量分为ｖ级，口级为均匀卵裂球，无碎片：口级卯裂球大小均匀，裂片＜２０％：口级卵裂球大小不均匀，碎片＜２０％：口级卵裂球大小均匀或不均匀，碎片２０％．５０％；口级卵裂球大小均匀或不均匀，碎片＞５０％。

卵裂球大小均匀，形态规整且碎片＜１０％的胚胎为优质胚胎，如图１１。

９、结果评价指标：统计卵子受精率、受精卯的卵裂率、优质胚胎比率、桑椹胚及囊胚形成率，以及早期胚胎在不同培养液中调亡的比较。

硕士掌位论文五、数据统计与检验
采用ＳＰＳＳ统计软件处理：数据采用百分数表示，用Ｘ：分期Ｊ榆验处删符２１【数据，Ｘ２分荆榆验足川，Ｊ：多个试验纠【和・个对照组的比较的方法，其中ａ＝Ｏ．０５，ａ‘＝ａ／ａ（ｋ．１），ｋ为率数。

ｔａ？＝７．８８。

结果
一、小鼠早期胚胎在不同培养液中受精及卵裂率的比较
授精后８ｈ检查受精情况。

正常受精的标准：见到两个独立的或有碎片的极体，同时有两个清晰的原核，如图４。

授精后卵细胞在不同培养液中的受精率无显著性差别。

受精后的鼠卵在卵泡液组和蜕膜细胞条件培养液组中的卯裂率是１００％，而在对照组和血清组中分别是９２，４％、９６．７％，各组分别与对照组进行Ｘ２分割统计分析得：卵泡液组和蜕膜细胞条件培养液组与对照组比较有显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０１），血清组和对照组比较无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。

优质胚胎的形成率在卵泡液组和条件培养液组中显著高于对照组，有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０１），而血清组的优质胚胎形成率与对照组比
较无显著性差异（Ｐ＞Ｏ．０５）。

另一分组中，血清加卵泡液组的卵裂率和优质胚胎形成率分别为１００％和９４．６％，血清加条件培养液组则分别为１００％不ｎ９５．４％，两组分别，ｉｊ血消组比较均有显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０１）。

见表１、２。

表ｌ：鼠卵在血清组、卵泡液组和条件培养液组
中受精及卵裂的比较
＋：Ｐ＜Ｏ．Ｏｌｐｓ对照组
表２：鼠卵在血清组、血清加卵泡液组和血清加条件培养液组
中受精及卵裂的比较
＋：Ｐ＜Ｏ０１ｗ对照组
二、不同培养液对小鼠早期胚胎发育的影响
每日用倒置显微镜观察可见：卵泡液组和蜕膜细胞条件培养液组的胚胎２４ｈ小时后大部分发育到８细胞期，４８ｈ发
育到桑椹期，７２ｈ可形成囊胚，９６ｈ可有囊胚孵出，在计算囊胚孵出率时，以培养１２０ｈ的鼠胚为准，囊胚孵化率在卵泡澉纰和蜕腆细胞条仆培养液纠川・发别口Ｊｊ厶剑２５．７％和３２ｌ％。

而对照组的胚胎发育速度明显缓慢，培养２４ｈ仅有９６个２细胞胚胎发育至８细胞期胚胎，４８ｈ有３０．９％发育到桑椹胚，７２ｈ仅有】９．】％发育至囊胚期，９６ｈ后偶可见有囊胚孵出。

在相同时间内，卯泡液组和蜕膜细胞条件培养液组分别与对照组比较，２细胞期发育至８细胞期数，差异有显著性（Ｐ＜０．０１）。

从２细胞期至桑椹胚和囊胚及至囊胚孵出，两者间差异均有显著性（Ｐ＜Ｏ．０１）。

在血清组中，从２细胞期至８细胞期，桑椹胚，囊胚及孵化囊胚，发育速度均比对照组快，胚胎发育率也均高于对照组，但无显著性差异（Ｐ＞Ｏ．０１）。

在另一分组中，鼠胚在血清加卵泡液组中分别有７２．７％，６２．３％，５１，２％和２８．５％发育到８．细胞期，桑椹胚，囊胚和孵化囊胚，而在血清加条件培养液组中则分别有７４ｌ％、６８．５％，６２．Ｏ％和３５，２％发育至８．细胞期，桑椹胚，囊胚和孵化囊胚。

各组与血清组比较均有显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０１）。

不同培养液对鼠胚发育的影响见表３、４。

表３：鼠胚在血清组、卵泡液组和条件培养液组中发育的比较组别２细胞朗
８嬲桑｝期王囊胚孵懈ｘｄ：｝！髫Ｒ２２０９６（４３０６８（３０９）４２（１９１）１２（５５）
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２３２１２４（５３４）９４（匏５）６８（２９．３）１８（７８）卵泡液组２７２１９４（７１．玎１６０（５８．８）．１３６（５００）‘
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三、小鼠早期胚胎在不同培养液中的凋亡
每日用倒置显微镜观察，鼠胚在４８ｈ和７２ｈ内，在卵泡液组和蜕膜细胞条件培养液组中无凋亡，在９６ｈ，１２０ｈ和１４４ｈ之后也仅有少量胚胎的凋亡。

而对照组中，４８ｈ即有２０个胚胎的凋亡，．Ｉ－胚胎数的９１％，７２ｈ之后凋亡数更多。

在相同时间内，鼠胚在卵泡液组和蜕膜细胞条件培养液组的凋亡数和对照组中的比较均有显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０１），而血清组与对照组比较无显著性差异（Ｐ＞Ｏ．０５），见表５。

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讨论
一、鼠卵在不同培养液中受精及卵裂的ｂ匕较
胚胎质量对妊娠结局有很大的影响，因此，一种准确反应胚胎质量的方法对任何一个ＩＶＦ实验室都是必须的。

目前各个ＩＶＦ实验室广泛采用形态学标准来判断胚胎的质量，可较好的预测胚胎的种植。

胚胎形态学分级要考虑几个参数：分裂球的数目、对称性、细胞外碎片的大小和多少ｆ３’４ｌ。

目前采用的胚胎分级方法ｆ５】能较好的反映胚胎质量。

本研究根据早期胚胎无种属要求的特性，采用将人卵泡液、人蜕膜细胞条件培养液和人血清加入培养液中，成功进行了小鼠胚胎培养方法的研究。

由表１、２可以看到培养液中加入卵泡液和蜕膜细胞条件培养液均有利于鼠卵的分裂和优质胚胎的形成。

实验结果提爪，卵泡液和蜕腆细胞町促进鼠胚发育为优质胚胎。

此结果与国外报道基本～致。

蜕膜细胞含有多种促进胚胎发育的物质，不仅能加速胚胎的分裂，而且能使胚胎较好的发育。

蜕膜细胞内存在大量糖原和脂肪提示蜕膜有营养功能。

蜕膜细胞条件培养液中含有细胞分泌的一些生物活性物质，对胚胎发育有利。

Ｄｅｓａｌ等【６Ｉ利用酶联免疫测定（ＥＬＩＳＡ）技术证实子宫蜕膜细胞能分泌胚胎发育所需的生长因子／细胞因子，如血小板衍生生长因子（ＰＤＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、白细胞介素６（ＩＬ．６），已证实这些因子皆可促进胚胎发育。

条件培养液中含有细胞分泌的生物活性物质。

卵泡液由血浆渗出物和局部的分泌物如氨基多糖和类固醇激素等组成。

早在１９６９年，人们就开始研究动物的卵泡液对精子的影响，许多研究结果表明，卵泡液能刺激精子的活力、诱导精子的运动、促进顶体反应并吸引精子向卵子移动，介导精子穿卵【７－９ｌ：卵泡液还能刺激卵子成熟【１０１、提高
山西医科大掌硕士掌位论文受精率…ｌ、阻止透明带硬化【１２】。

卵泡液中存在某些促进哺乳动物胚胎发育的生长因子，如ＥＧＦ、胰岛素样生长因子（Ｉ（ｊＪ氓ｊ：０化７１－Ｋ…Ｊ：（ｒＩ（ｊＩｉ），ＪＬ作川化｛Ｈ人删艘卜决定竹胍胎能否发育到囊胚期以及优质胚胎形成的数量。

二、不同培养液对小鼠早期胚胎发育的作用
对昆明鼠是我国目前使用广泛的一种远交品系小鼠，其早期胚胎在体外培养中表现出严重的２细胞阻滞现象ｌ＂１。

本实验研究显示：鼠胚在卵泡液组和蜕膜细胞条件培养液组中发育速度和囊胚及桑椹胚形成率与对照组比较有显著性差异，提示卵泡液和蜕膜细胞可促进鼠胚的发育。

在培养基中补充一定量的生物性体液或组织提取液能促进胚胎发育的机理至今不明，推测可能与以下因素有关：（１）在培养环境中存在某些对胚胎有营养作用及促进胚胎发育的成分，如白血病抑制因子、营养细胞分泌生长因子、细胞因子及其他蛋白，表皮生长因子等：（２）去掉某些毒素、重金属及代谢性抑制因子：（３）可以产生低氧环境，促进胚胎发育：（４）培养环境不受上皮细胞或纤维母细胞的限制，无种属特异性。

１、蜕膜细胞促进胚胎体外发育的机理：自然状态下，
卵受精发生在输卵管壶腹部，受精ｄ３时形成一个由１２一１６个细胞构成的实心胚即桑椹胚，桑椹胚继续发育，到受精后ｄ４发育成囊胚，火约在受精后ｄ６—７，胚胎开始植入，至ｄ１４完成植入。

人类胚胎在体外培养，仅有ｌ５—２０％的胚胎能发育到囊胚期，大多数胚胎在体外培养到ｄ５即终止发育。

因此，许多学者提出将胚胎与体细胞一起共培养，共培养体系是指把胚胎放在辅助细胞上共同培养，以促进胚胎发育。

共培养所用的细胞有人输卵管壶腹部细胞【Ｈ１、Ｖｅｒｏ细胞【１５】、胎牛子宫纤维母细胞【１６Ｊ、牛输卵管上皮细胞１１７１、人子宫内膜细胞¨８１等，这些辅助细胞在不同程度上促进了胚胎的发育。

本次实验的结果由表１、２可以看出，条件培养液组和血清加条件培养液组的鼠胚发育至各期的细胞数均较对照组有显著差异，提示，培养液中加入蜕膜细胞条件培养液有助于鼠胚的发育。

此结果与张丽风等【１９１的报道基本一致。

蜕膜细胞以其营养胚泡、调节内分泌、调控滋养细胞的侵入、防止胚胎被母体排斥等功能，成为一种被广泛采用的饲养细胞。

蜕膜细胞不仅分泌胚胎营养物质，也能随着胚胎发育的不同阶段提供适当的微环境，通过代谢途径，清除培养液中对胚胎发
育不利的成分。

另外，蜕膜细胞可能产生一些特异因子，克服体外培养中胚胎透明带硬化过程，使胚胎透明带变薄，囊胚易于孵出着床，提高妊娠率。

２、卯泡液促进胚胎体外发育的机理：１９９４年Ｈｅｍｍｉｎｇｓ等ｆ５｜报道，人卵泡液对人早期胚胎发育有促进作用。

１９９８年Ｃｈｉ等【２０Ｈ哿卵泡液对人早期胚胎发育影响的试验研究引入临床，发现培养液中添加卵泡液能提高ＩＶＦ．ＥＴ的妊娠率。

卵泡液的组成成分非常复杂，因而其对早期胚胎发育的作用机理也是相当复杂的，不能单纯用某种物质来解释。

早期鼠胚的生命活动主要表现为细胞的分化和增殖。

由表１、２可看出本研究结果：卵泡液组和血清加卵泡液组的鼠胚发育速度快，囊胚形成率高，从结果可以看出，人卵泡液可刺激胚胎发育，改善胚胎质量。

文献报道，卵泡液培养的鼠胚内，细胞数远多于非卵泡液培养的鼠胚【５Ｉ，人卵泡液对鼠胚的营养作用，可能是由于其内含有多种生长因子。

吴茜等｛２１Ｊ的研究结果显示，卵泡液抑制鼠胚体外发育，与本研究结果相反，可能与卵泡液来源有关。

本研究卵泡液取自健康成熟的卵泡，而吴茜用于研究的卵泡液未经选择，其中可能含有未成
熟卵泡或闭锁卵泡的卯泡液，未成熟卵泡的卵泡液中含有卵子成熟抑制因子（０ＭＩ）；而成熟卵泡的卵泡液中ＯＭＩ的作用被黄体激素解除。

同时，成熟卵经历黄体生成高峰，黄体生成素可使促成熟因子（ＭＰＦ）活化。

李娟，张丽红等【２２１研究结果显示卵泡液内表皮生长因子（ＥＧＦ）含量明显高于血清中，推测高水平的ＥＧＦ对早期胚胎发育有促进作用。

文献报道，在小鼠胚胎体外发育过程中加入ＥＧＦ，可明显提高鼠胚的生长速率，发育到囊胚期和孵出的胚泡比例明显高于对照组１２３Ｉ。

综上所述，卵泡液具有克服２细胞期鼠胚体外发育阻滞、促进小鼠早期胚胎体外发育、提高鼠胚孵出率的作用。

卵泡液中含有较高水平的ＥＧＦ，这可能是卵泡液对早期鼠胚发育的促进作用强的重要因素。

３、血清对早期鼠胚体外发育的影响：血清来源较为丰富、易于保存且含有多种生长因子而被广泛应用于ＩＶＦ及胚胎培养，但以往研究结果发现，血清不能有效突破鼠胚的２细胞阻滞。

本研究结果也发现，小鼠受精卵在添加血清培养液中培养时，鼠胚常常停滞在２细胞期而不再向前发展，提示血清内含有胚胎毒性物质。

Ｈｅｍｍｉｎｇｓ等ｆ５１对添加卵泡液
山西医科大掌硕士掌位论文和血清的培养基中的低分子蛋白分析发现，在血清培养基中含有相对分子质量为１７０００的两条带，而卵泡液培养基中不存在该蛋白；已知纤维母细胞生长因子棚对分子质量为１７０００，Ｃｏｌｖｅｒ等ｆ２４ｌ用限定性培养基，增加其中纤维母细胞生长因子浓度，不利于胚胎发育到桑椹期及滋养细胞期。

提示血清培养基中胚胎毒性物质较卵泡液培养基中多。

三、小鼠早期胚胎在不同培养液中调亡的比较
鼠胚在卵泡液组和蜕膜细胞组中各个时期的凋亡率均与对照组有显著性差异，从而进～步证实了卵泡液中蜕膜细胞含有促进卵泡发育的物质，提示在培养基中加入卵泡液或辅助细胞的条件培养液有利于鼠胚的发育。

四、今后研究趋势
我们对胚胎发育所需物质和生长的微环境的了解还远远不够，不仅要通过对照方式增减培养液内的成分和浓度来确定最佳培养液，还需加强对胚胎在体内发育及其微环境的基础研究。

进一步研究胚胎种植机理及细胞因子或激素等对该过程的作用。

Ｒｏｕｄｅｂｕｓｈ等【２５ｌ将鼠胚分别在人卵泡液中及鼠胚丘细胞上培养，效果不明显。

而将鼠胚与鼠卯丘细胞和人
卵泡液一同培养，却显著提高胚胎囊胚发育率及囊胚的细胞数，说明人的卵泡液和鼠的卵丘细胞有协同作用。

本实验的创潮ｉ之处在。

ｎ川血消和卯泡波及条件培养液』０刚』ＪＵ入培养液中，结果显示，此利・培养体系更有利于鼠胚的发育，【｝毛明血清与卵泡液及条件培养液有协同作用，以后研究要着重于这种协同作用的机理。

迸一步测定加入培养基中的不同体液的成分以确定是何种物质对鼠胚的发育起促进作用。

人们对不同培养体系促进胚胎发肖的机理仍知之甚少，这些都仃待更加深入的研究。

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山西医科大掌
・综述・
小鼠胚胎体外培养的研究
摘要哺乳动物受精胚的体外培养是人工辅助妊娠的关键环节之一，长期以来，有关学者不断致力于改进该项技术。

试图达到理想的培养效果。

本文从建立各种联合培养体系这个方面作一综述。

关键词胚胎培养液联合培养
适宜的培养体系是动物胚胎生物技术、胚胎分割、胚胎克隆、外源ＤＮＡ注射等的基础条件和有效工具。

另外，胚胎发育至桑椹胚或囊胚阶段，胚胎移植妊娠的成功率会大大增加。

这就要求，早期胚胎的体外培养多达７ｄ之久。

然而，常规体外培养的胚胎发育率低，胚胎质量差，为解决这一难题，研究者们不断探索改进胚胎体外培养的技术方法。

其中，利用各种辅助细胞或生物性体液及组织提取液建立联合培养体系能可靠、有效地增加胚胎的成活率和发育率。

本文从建立联合培养体系入手建立一套适合于昆明小鼠
１ｎ。