水处理微生物学 第七章 微生物的研究方法

第四节 灭菌
一、概念 消毒：指只杀死一部分微生物，主要是病 原微生物。 灭菌：指杀死一切微生物，包括芽孢和孢 子。
二、方法 高温灭菌法是微生物实验中常用的 灭菌法，其中包括烧灼、干燥热空 气灭菌和湿热灭菌等方法。
1、灼烧 微生物接种工具如接种环、接种 针或其他金属用具等，可直接在酒 精灯火焰上灼烧进行灭菌。这种方 法灭菌迅速彻底。此外，接种过程 中，试管或三角瓶口等，也可通过 火焰灼烧灭菌。
1、微生物的培养的意义：在鉴别不同种类的微生 物时，显微镜下观察到的各种形态、微细结构 和染色的反应，都是很重要的指标。但是因为 微生物的形态类型比较单纯，微细结构也不多， 不足以区别各种各样的菌种，因此，要区别各 种不同的菌种，在形态特性之外还必须研究其 培养持性，即当微生物在培养基上生长时能观 察到的一切持性。此外，在进行增殖培养时， 也须采用合适的培养基，以培养繁殖大量微生 物，供工业农业医学及科学研究等方面的需要。
干燥热空气灭菌注意事项
(1) 灭菌的玻璃器皿切不可有水，有水的玻璃器皿 在干热灭菌中容易炸裂。 (2) 灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温 度均匀上升。 (3) 灭菌物品不能直接放在电烘箱底板上，以防 止包装纸或棉花被烤焦。 (4) 灭菌温度恒定在160～170℃为宜。温度超过 180℃，棉花、报纸会烧焦甚至燃烧。 (5) 降温时，需待温度自然降至60℃以下才能打开 箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导 致玻璃器皿炸裂。 (6) 培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热 灭菌。
多数细菌和真菌的营养细胞在 60℃左右处理15min后即可杀死，酵母 菌和真菌的孢子要耐热些，要用 80℃以上的温度处理才能杀死，而 细菌的芽胞更耐热，一般要在120℃ 下处理15min才能杀死。
湿热灭菌注意事项
(1) 不要将灭菌锅安装在有易燃气体或液体的地方，确认仪器所注电压与当地 电压相同，蓝线为零线，棕线为火线，黄/绿线为地线，务必要将仪器接 地良好。 (2) 每次使用前，应检查灭菌锅内有足够水量，使水位过电热管。 (3) 摆放灭菌物品时，严禁堵塞安全阀的出气孔，必须留出空位保证其畅通放 汽，否则安全阀因出汽孔堵塞不能工作，造成事故。 (4) 每次开门前，一定要检查确认锅内无压力！压力指示表必须指示为0！ (5) 如果使用仪器的过程中发现有超温及超压等异常现象，请断开电源，开关 处于OFF位置，并将插头从电源处拔下，待机器压力降下来为零时，再打 开锅盖进行检查。 (6) 灭菌液体时，应将液体灌装在硬质的耐热玻璃瓶中，以不超过3/4 体积为 好，瓶口选用棉花纱塞，切勿使用未打孔的橡胶或软木塞。 (7) 对不同类型，不同消毒物要求的物品，如敷料和液体等，切勿放在一起消 毒，以免顾此失彼，造成损失。 (8) 平时应将设备保持清洁和干燥，方可延长使用年限，橡胶密封垫使用日久 会老化，应定期更换。 (9) 安全阀应定期检查其可靠性，工作压力超过0.165 兆帕时需要更换合格的 安全阀。 (10)使用间歇法或持续法灭菌时必须在灭菌物里外都达到100℃后，开始计算 灭菌时间
2、培养基的分类
按照培养基制成的形式，可分为 （1）液体培养基：增殖、鉴定微生物 （2）固体培养基两种：分离、保藏菌 种及鉴定微生物 a 平板培养基：分离、鉴定微生物 b 斜面培养基：培养、保藏菌种
另：常用的凝固剂是琼脂(洋菜)，当加入1.5％ 常用的凝固剂是琼脂(洋菜) 当加入1.5％ 1.5 时就形成固体，而加入0.5％－0.8 0.5％－0.8％ －3％时就形成固体，而加入0.5％－0.8％时， 则成半固体。 则成半固体。
一、菌种的保藏 1、注意（1）防止死亡绝种（2）防止变 异 2、方法（1）低温：斜面冰箱保藏法是最 简便的一种。 （2）干燥 （3）真空
二、菌种的衰退与复壮 1、菌种衰退的原因（1）变异（2）自然 “衰老” 2、复壮措施：因为变异引起的衰退是逐 步发生的，所以采用稀释分离的方法， 往往就可将尚未变异的个体分离出来， 获得原有特性的菌种；但自然“衰老” 的菌种分离后一般得不到复壮的效果； 如果衰退是由于培养条件不太适宜，则 就应改变条件以适应菌种的生长，而达 到复壮的目的。
二、染色观察 1、细菌不但个体很小，而且都是无色半 透明的，用普通显微镜放大，只能粗略 地看到其大小和形态。要观察清楚，必 须进行染色。染色后还有可能识别细菌 的各种不同结构，有时并可协助鉴别细 菌。 2、染色方法可分为单染色法和复染色法 两种
三、活菌观察
第二节 微生物的培养和纯种分离
一、微生物的培养及培养基
第七章 微生物的研究方法
主要内容：微生物的观察 微生物的培养和纯种分离 微生物的保藏与复壮 灭菌 无菌操作
第一节 微生物的观察
一、显微镜观察 普通光学显微镜：普通光学显微镜最大能 将物体放大2000倍左右，通常观察霉菌和 酵母菌时。采用100－400倍的放大率已足 够，而观察细菌时，往往需要放大900－ 1500倍左右。 电子显微镜：电子显微镜的放大倍数常达 几十万倍，过去无法看到的病毒以及细 菌内部的微细结构都可以看清楚。
（2）高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌法是一种湿热灭菌（根 煮，所以蒸汽的压力可以高于大气压， 蒸汽温度也随着升高，当容器内的蒸汽 压达到一个大气压时，水的沸点提高到 121℃，在这个温度下只需很短的时间就 可杀死一切微生物的细胞及其芽孢或孢 子。表7－2所列是高压灭菌器中温度与压 力的关系。
据灭菌时压力大小可以分为常压蒸汽灭菌和高 压蒸汽灭菌）方法，是利用密闭的容器蒸
2、干燥热空气灭菌 用干燥热空气杀死微生物的方法称 为干热灭菌。通常将灭菌物品用锡箔纸 包裹好或放入灭菌专用的铁盒(或铝盒) 内，置于鼓风干燥箱内，在160℃～170℃ 加热1～2h。灭菌时间可根据灭菌物品性 质与体积作适当调整，以达到灭菌目的。 玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用 具等凡不适于用其他方法灭菌而又能耐 高温的物品都可用此法灭菌。
第五节 无菌操作
为了在研究某种微生物的过程中减少其它微 生物的干扰和影响，必须为所研究的微生物提供 一个无其它杂菌的环境，创建这一环境的技术即 为无菌技术。 在实施无菌技术中，须牢记自然环境中微生 物是无处不在的，从而在无菌操作中形成必要的 “无菌概念”。所有无菌实验操作都是建立在此 观念上。 在微生物学实验中，无菌操作主要包括斜面 接种、液体接种、平板接种、倒制平板和稀释分 离等。
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在相同温度下，湿热灭菌比干热灭菌效 果好的原因是： ①热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水 分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维 结构的氢键和其他相互作用弱键，更易 使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固 温度成反比； ②热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效 地杀灭微生物； ③蒸汽存在潜热，当气体转变为液体时可 放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体 的温度。
3、湿热灭菌
湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌，根据灭菌 时压力大小可以分为常压蒸汽灭菌和高 压蒸汽灭菌。
（1）常压蒸汽灭菌
在不能密闭的容器里产生蒸汽进行灭菌。所用 的灭菌器有阿诺氏(Aruokd)灭菌器或特制的蒸锅，也 可用普通的蒸笼。常压蒸汽灭菌比较有代表性的是 巴氏消毒法和间歇灭菌法。巴氏消毒法用于牛奶等 不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要 目的是杀死其中的无芽胞病原菌，而又不影响其特 有风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法，具体的处 理温度和时间各有不同，一般在85℃下保持5min即 可。间歇灭菌法又称分段灭菌法，适用于不耐热培 养基的灭菌，方法是将待灭菌的培养基在100℃下蒸 煮30～60min，以杀死其中所有微生物的营养细胞， 然后置室温或20～30℃下保温过夜，诱导残留的芽 胞萌发，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连 续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。
（四）纯菌种直接处理废水所存在问题 把大量分离出的适宜于分解某种物 质的菌种投入到污水处理构筑物内，则 这一类微生物在短时期内确能在构筑物 内取得优势地位，从而提高该物质的去 除效率。但处理构筑物内的优势菌种会 随着条件的改变而发生变化。因此，菌 种投入经一段时间后，处理效果有可能 下降。
第三节 微生物的保藏与复壮
二、微生物纯种的分离 （一）菌种分离的主要步骤（图7－6） 1、寻找菌种的样品 2、增殖培养 3、分离培养：稀释平板法 、平板划线法 4、接种到斜面培养基：进行再培养，并进 行性能测定，以确定符合要求的纯种。
（二）培养、分离微生物常用的培养基
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（三）培养条件的控制 1、控制温度 2、控制氧气 3、控制培养基成分 4、控制培养基的酸碱度(pH) 5、使用抑制剂