一氧化氮及其合酶在杀伤肿瘤细胞中的作用(一)

一氧化氮及其合酶在杀伤肿瘤细胞中的作用(一)

关键词：巨噬细胞肺泡一氧化氮合酶肿瘤活化的巨噬细胞(M)在抗肿瘤过程中具有十分重要的意义。一氧化氮(NO)作为活化的M的细胞毒效应分子之一，在杀伤肿瘤效应中起重要作用〔1〕。本研究通过测定肺M内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及其产物NO水平，并应用特异性NOS抑制剂来观察肺M对肿瘤细胞杀伤作用的影响，旨在探讨肺MNOS 活性与肿瘤杀伤力之间的关系，以阐明肺M在抗肿瘤免疫中的地位。1材料和方法

1.1肺M的制备及培养体质量20～25g的纯种C57雄性小鼠32只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,随机分成实验组和对照组，每组16只，均经腹腔注入2%戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉放血处死,暴露颈部气管后,用37℃生理盐水进行支气管肺泡灌洗,每次1ml,共15次。将回收的灌洗液以1500r/min离心10min,弃上清,用含10%小牛血清的最低必需培养液(MEM)配成1×106个/ml的细胞悬液。将细胞悬液接种于96孔板中,37℃,5%CO2培养2h,洗去未贴壁细胞,根据需要分别加入不同剂量(50，100，150，200U/ml)的干扰素γ（INFγ）,继续培养24h。

1.2肿瘤细胞培养上清液的收集将无菌取得的肥大细胞肿瘤细胞P815(上海肿瘤研究所提供)以5×105个/ml的密度培养在RPMI1640培养液中,置37℃,5%CO2培养箱培养48h,2500r/min离心20min,取上清液,置-20℃保存待用。

1.3iNOS活性测定用Smith薄层层析法〔2〕测定上清液培养标本中瓜氨

酸(citrulline)的生成量，以此反映iNOS的活性。

1.4NO测定10mmol/L硼酸钠溶液系列稀释10mmol/L亚硝酸钠，测定其相应于波长为545nm时的光密度(D)值,作曲线,并得出直线回归方程式〔3〕。取上清培养液，加入等量的Greiss试剂（1%磺胺、0.1%萘乙二胺、

2.5%磷酸),室温放置10min，545nm比色，根据直线回归方程计算出NO含量。

1.5肺M肿瘤杀伤活性测定在培养板内加入肺M悬液100μl/孔，实验组再加入2mmol/LNG单甲基左旋精氨酸（L-NMMA，Sigma公司），50μl/孔，置37℃，5%CO2培养箱培养4h，再加入含10%P815上清液的营养液100μl/孔，置37℃,5％CO2培养72h。每孔加二甲基亚砜(DMSO)100μl,混匀静置20min,在PG-3022酶联仪上用570nm波长测定D值,计算肿瘤细胞生长抑制率。

1.6统计学处理所有数据采用X±s表示，组间显著性检验用配对资料t 检验，各指标进行直线相关分析。

2结果

2.1不同剂量INFγ对肺M产生NO的影响不同剂量的INFγ与活化的肺M共同培养24h后,培养液中NO含量随着INFγ剂量的增加而升高(图1),且呈明显的剂量依赖关系(r=0.985,t=19.89,P＜0.01)。

图1INFγ对肺巨噬细胞NO产生和iNOS活性的影响

fig1TheeffectofINFγonNOproductionand activityofiNOSbymacrophages

●:NO;▲:iNOS

2.2INFγ对肺MNOS活性的影响不同剂量INFγ作用于肺M后，肺MiNOS 活性随INFγ剂量的增加而升高（图1）,与INFγ的剂量有明显的相关性(r=0.990,t=19.78，P＜0.01)。

2.3L-NMMA对肺M肿瘤杀伤活性的影响活化的肺M与P815单独作用时，其培养上清液中NO的浓度为(18.47±5.00)μmol/L，而预先加入L-NMMA再培养的上清液中NO浓度为(11.07±4.06)μmol/L，两组之间有显著性差异(P＜0.05)；未加L-NMMA组肺M对P815细胞生长的抑制率为66.6%，预先加入L-NMMA组为4

3.3%，较前者明显降低〔两组D(570)值分别为0.132±0.032和0.292±0.065，P＜0.05〕。

3讨论

NO由L-精氨酸经NOS作用而生成。NOS主要有两种同工酶：结构型(constitutive,cNOS)和诱导型（inducible,iNOS)。M、库普弗细胞是iNOS 的主要表达细胞，因此从肺M内测得的为iNOS〔4〕。某些细胞因子，如INFγ、TNFα、IL-2等可诱导iNOS的活性，增加NO的合成〔5〕。

活化的M具有杀伤肿瘤细胞的能力,其作用机制是多样的,可能是通过细胞间的联接或是依赖于一种或多种细胞毒效应分子，包括IL-2、过氧化氢、TNF等。自1985年发现活化的M可产生NO以来〔6〕，随着有关NO研究的深入，越来越多的结果表明NO与活化M杀伤肿瘤细胞的作用密切相关。Hibbs等〔7〕首先发现在缺乏精氨酸的培养条件下，活化的M的细胞毒效应作用不能表达，由此推测精氨酸的分解代谢产

物NO是活化的M的细胞毒效应分子。以后的研究证实了NO具有抑制细胞生长和细胞毒性作用。本研究发现，活化的肺M可以产生NO，并对肿瘤细胞P815有杀伤作用；在加入作为NOS的竞争性抑制剂的L-NMMA后，NOS代谢产物NO减少，对P815的杀伤作用也相应减弱，从而也证实了由iNOS催化产生的NO是活化的肺M杀伤肿瘤细胞的一个重要的效应分子。

NO介导杀伤肿瘤细胞的机制可能是其与铁硫键（Fe-S）基团作用，形成铁-亚硝基复合物，从而引起顺乌头酸酶(aconitase)和线粒体呼吸链上的复合物Ⅰ与复合物Ⅱ中的Fe-S辅基的纯化与降解，从而引起细胞毒性〔8〕。肿瘤细胞内铁的大量丧失，破坏了许多代谢酶的活性，因此可阻断肿瘤靶细胞的能量代谢和DNA复制。同时活化的M产生的NO 可通过促进细胞内cGMP的升高来诱导并促进细胞凋亡的发生，从而抑制肿瘤细胞生长或引起肿瘤细胞的凋亡〔9〕。

综上所述，肺M内iNOS及其代谢产物NO与肺M肿瘤杀伤作用之间存在着明显的关系，通过各种手段提高肺MNO的产生，可能为肺癌的治疗提供一条新的途径。