轻度酶解对大豆蛋白胶凝性和疏水性的影响

来源 地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶 枯草芽孢杆菌中性蛋白酶
表 １ 两种蛋白水解酶的相关性质［７～９］ Table 1 Some properties of two proteinases［７～９］
作用位点 内切肽酶 内切肽键酶
性质 最适工作条件 ｐＨ６．５～８．５，温度 ５５～７０℃（取决于底物） ｐＨ６．５～７．５，温度 ４０～５５℃（取决于底物）
在豆奶中加入蛋白酶，可使豆奶中大豆蛋白分子适 度降解，然后再喷雾干燥成豆奶粉，此种豆奶粉在速 溶性、耐热性和除腥味方面都有较大幅度的改善［ ３ ］；但
是大豆蛋白经酶解后，由于肽链变短而没有足够长的蛋 白质链来构成凝胶网络结构，导致胶凝性质受到影响。
对于无糖速溶速凝豆奶粉而言，首先要求的是高溶 解性，这是产品速溶的基础，更为产品的进一步胶凝 提供充足的可溶性大豆蛋白，以保证最终产品豆腐花有 足够的强度；但同时又必须保证蛋白溶解性的提高不会 导致蛋白质凝胶性能的下降。因此，本研究以豆奶浆 料的凝胶强度 Ｈ 为主要指标，研究了两种蛋白酶轻度酶 解对豆奶浆料中大豆蛋白胶凝性的影响，并考察了此时 大豆蛋白表面疏水性 Ｓ ０ 的变化情况。
Ａｂｓｔｒａｃｔｓ： Ｈａｒｄｎｅｓｓ ｏｆ ｓｏｙ－ｃｕｒｄ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（Ｓ０） ｏｆ ｓｏｙ ｉｓｏｌａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｆｔｅｒ ｌｉｍｉｔｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｂｙ Ａｌｃａｌａｓｅ ａｎｄ Ａｓ １．３９８． Ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ， ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｇｅｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｏｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔｅｄ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ（ＤＨ）． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｌｉｍｉｔｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ｓｏｙ ｍｉｌｋ；ｓｏｙ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｇｅｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ；ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ 中图分类号：ＴＳ２０１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００５）１２－００３７－０４
１．３．６ 不同水解度大豆分离蛋白表面疏水性的测定 荧光探测剂 Ａ Ｎ Ｓ 法［５］ 。
２ 结果与讨论
２．１ 两种蛋白水解酶的相关性质 在大豆蛋白经蛋白酶水解以提高其功能特性的研究
中，可供选择的酶有动物蛋白酶、植物蛋白酶以及微 生物蛋白酶三大类，然而考虑到动物蛋白酶价格昂贵、 副反应多；植物蛋白酶来源少、效率低、不适合工业 化生产等缺点；并且随着生物技术的进步，微生物蛋白 酶随产酶技术日趋成熟，价格逐渐降低，而且来源广 泛，是比较理想的酶源［６］。所以本研究采用 Ａｌｃａｌａｓｅ 碱 性蛋白酶 和Ａｓ １．３９８中性蛋白酶这两种微生物蛋白酶作 为酶源，其相关性质见表 １ 。
１ 材料与方法
１．１ 主要材料 原料：东北圆粒大豆 市售。 试剂：葡萄糖酸内酯 上海绿宇食品添加剂有限公
司；Ａｌｃａｌａｓｅ Ｎｏｖｏ公司；Ａｓ １．３９８中性蛋白酶 无 锡杰能科生物技术有限公司；１－ 苯胺基萘 －８－ 硝基苯甲 酸盐（ＡＮＳ） 日本东京化成工业株式会社；干酪素 上海
０．５
１
１．５
２
２．５
０
０．５
１
１．５
２
２．５
ＤＨ（％）
（Ｅ／Ｓ分别为Ａｌｃａｌａｓｅ ０．３ｍｌ／１００ｇ ｐｒｏ和Ａｓ １．３９８ ０．２５ｇ／１００ｇ ｐｒｏ）
Fig.1
图 １ 豆浆中大豆蛋白水解度与凝胶强度的关系 Relationship between soyprotein hydrolysis degree (DH)
and gel strength
从图 １ 中看出：随着水解度的增加，各个水解样 品的凝胶强度都呈现下降的趋势，可见，这两种蛋白 酶的水解作用对于提高大豆蛋白的胶凝性质并不十分有 利。这主要可能是因为蛋白质分子肽链长度逐渐变短的 缘故，而这种较短的肽链转动自由度变大，空间位阻 变小，因此彼此之间相互缠绕形成网络结构的能力也就 减弱，因而凝胶强度也就降低，同时每一个肽键断裂 之后就形成一对新的氨基和羧基末端，使蛋白质的亲水 性和溶剂化程度增大，这也可能使其胶凝能力减弱。
１．４４７×１０５ ２．９４２×１０５
２．２ 水解度对豆浆胶凝性质的影响 通过对豆奶浆料进行酶法水解，可将浆料中的大分
子蛋白质水解成小分子肽类和氨基酸，因此提高了大豆 蛋白的溶解性，降低黏度，同时还能提高大豆蛋白的 生物效价，易为人体消化和吸收［ １ ０ ］ 。而过度水解，虽 然在很大程度上缩短了肽链长度，增加了溶解性，但 同时，原先埋藏在长肽链结构内部的疏水性氨基酸大量 暴露而导致苦味的产生，这对于食品饮料而言是不可接 受的。实际上，大豆蛋白质在水解的初始阶段是没有 苦味的［ １ １ ］，所以，在保证无苦味、并且溶解性略有提 高的基础上，要想提高豆奶浆料中大豆蛋白的胶凝性 质，只能对蛋白质进行限制性轻度水解。
保温 ３０ｍｉｎ 后置于冰浴中冷却至室温，于 ＴＡ．ＸＴ２Ｉ 物性 测试仪上测定凝胶强度。凝胶强度测定的工作参数如 下：
探头型号 Ｐ／０．５；Ｐｒｅｔｅｓｔ Ｓｐｅｅｄ ５．０ ｍｍ／ｓ；Ｔｅｓｔ Ｓｐｅｅｄ ２．０ ｍｍ／ｓ；Ｐｏｓｔ Ｔｅｓｔ Ｓｐｅｅｄ ５．０ ｍｍ／ｓ；Ｄｉｓｔａｎｃｅ ２０．０ｍｍ。
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｎ Ｇｅｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ＳＵＮ Ｘｉｎ１，ＷＡＮＧ Ｚｈａｎｇ２，ＷＡＮＧ Ｌｉ１，ＣＨＥＮ Ｌｉ２ （１．Ｘｕｚｈｏｕ Ｖ Ｖ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｂｅｖｅｒａｇｅ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｘｕｚｈｏｕ ２２１００３， Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｘｉ ２１４０３６， Ｃｈｉｎａ）
１．３．１ 浆料蛋白浓度的测定 按浸泡（大豆：０．５％ ＮａＨＣＯ３ 溶液 ＝１：２．５，１０～１５ｈ）
→脱腥（水温 ９０～９５℃，时间 ５ｍｉｎ）→打浆（浆渣分离，料 水比为 １：６，洗两次渣）的工艺得到生豆浆，精确称取 ５ｇ 用凯氏定氮法（ＧＢ５００９．５－８５）测定蛋白质浓度。
１．３．２ 蛋白酶活力的测பைடு நூலகம் 采用改进福林显色法，各种蛋白酶在最适温度和
酶活标准曲线：ｙ＝０．００９１ｘ － ０．００１５，从直线的斜率 计算 Ｋ 值：Ｋ ＝ １ １ ０ ． ０ ５ ５。
１．３．３ 豆浆的轻度酶水解 将经过预热处理（９５℃保温 １５ｍｉｎ）的豆浆 １５００ｇ用酶
反应器保温在蛋白酶的最适作用温度下， 调节 ｐＨ 至 ７．０，加入一定量的蛋白酶进行水解并采用 ｐＨ－ｓｔａｔ 法控 制体系的 ｐ Ｈ ，根据滴加的碱量控制所需制备的水解度。
热稳定性 ｐ Ｈ ８ ，８ ５ ℃以上 １ ０ ｍ ｉ ｎ ；ｐ Ｈ ４ ，５ ０ ℃３ ０ ｍ ｉ ｎ ｐＨ７．０～８．０ 条件下，６０℃１０ｍｉｎ 全部失活
化学试剂采购供应站分装厂；牛血清蛋白（ＢＳＡ） Ｓｉｇｍａ 公司；ＳＤＳ（十二烷基硫酸钠） 生化试剂；三氯乙酸 上 海化学试剂采购供应站；大豆分离蛋白 自制（碱提酸沉 法） ；其他试剂均为分析纯。 １．２ 主要仪器
※基础研究
食品科学
2005, Vol. 26, No. 12 37
轻度酶解对大豆蛋白胶凝性和疏水性的影响
孙 欣 １，王 璋 ２，王 莉 １，陈 莉 ２ （１．徐州维维食品饮料股份有限公司，江苏 徐州 ２２１００３；
２．江南大学食品学院，江苏 无锡 ２１４０３６）
摘 要 ：以豆奶浆料的凝胶强度 Ｈ 以及大豆分离蛋白的表面疏水性指数 Ｓ０ 为主要指标，研究了热处理后的豆奶浆 料经 Ａｌｃａｌａｓｅ 碱性蛋白酶 和 Ａｓ １．３９８ 中性蛋白酶分别轻度酶解后，豆奶浆料中大豆蛋白胶凝性质随水解度的变化， 并考察了限制性酶水解对大豆蛋白表面疏水性 Ｓ ０ 的影响。 关键词：轻度酶解；豆奶；大豆蛋白；胶凝性；疏水性
分离式磨浆机（ＦＤＭ－Ｚ１００） 江苏丹徒葛中电器五 厂；定时恒温磁力搅拌器（ＧＢ－９０－２ 型） 上海天平仪器 厂；ＪＢ 系列搅拌机调速器 上海标本模型厂；酶反应 器 自制；ＴＡ．ＸＴ２Ｉ物性测试仪 英国Ｓｔａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ 公司；紫外分光光度计（Ｔ７０１） 北京瑞利分析仪器公 司；荧光分光光度计（ＨＩＴＡＣＨＩ ６５０－６０） 日本岛津公司。 １．３ 实验方法
１．３．４ 水解度的测定 由于制得的豆浆为中性，故采 用ｐＨ－ｓｔａｔ法［４］
１．３．５ 轻度酶水解豆浆凝胶强度的测定 将水解后的豆浆分装在 ２５ｍｌ 的烧杯，２５ｇ／ 份，置
于 ８０℃水浴中，每份加入 ０．５ｍｌ 新鲜配制的 １ｍｏｌ／Ｌ ＧＤＬ 溶液，使得最终体系中的 ＧＤＬ 质量百分浓度为 ０．３３％ ，
ｐ Ｈ ７ ． ０ 下，进行测定。 酶活力单位：在特定的实验条件下，每分钟水解
酪蛋白产生 １μｇ 酪氨酸的酶量为一个酶活单位。 酶活力（单位数 ／ｇ 酶制剂）＝４／１０ × Ｋ × ＯＤ × ｎ 式中：４ —反应混合物总体积为 ４ｍｌ；１０ —酶反应
时间；Ｋ —标准曲线中 Ｏ Ｄ 值为 １ 时相当的酪氨酸微克 数；ｎ —酶的稀释倍数。
※基础研究
食品科学
2005, Vol. 26, No. 12 39
相对凝胶强度 Ｈ／Ｈ０ 表面疏水性指数 Ｓ０
本研究考察了不同水解度的浆料加凝固剂胶凝后的 凝胶强度 Ｈ 这一指标，结果见图 １ 。
１．１
ＡＡｌｌｃｃａａｌｌａａｓｓｅｅ
０．９
ＡＡｓｓ １１．．３９３８９８
０．７
０．５
０．３
０．１
－０．１０
随着水解度的增加，两个样品凝胶强度都出现一个 峰值：Ａｓ １．３９８ 作用下豆奶浆料大豆蛋白水解度为 １．５ 时，样品凝胶强度最大；而 Ａｌｃａｌａｓｅ 作用下豆奶浆料 大豆蛋白水解度为 １．０ 时，样品凝胶强度最大。这可能 是因为在水解度较低的情况下，肽链仍较长，而原先 埋藏在蛋白质结构内部的疏水性氨基酸已经在一定程度 上暴露出来，使得肽链间的疏水相互作用增强所导致； 此后，酶进一步发挥作用，水解度继续增大，肽链越 来越短，以致没有足够的长度来构成蛋白质网络，所 以凝胶强度下降。
蛋白质的主要改性方法有非酶法（ 物理、化学法） 、 酶法和混合法等。酶法改性具有许多物理、化学改性 无可比拟的优点：营养价值不会降低、反应条件温和、 设备要求低、效率高、作用具有独特专一性、反应进 程容易控制、无不良副反应和总体安全等［ １ ］ 。
热处理是大豆蛋白形成凝胶的必备前提，但生豆浆 体系经加热后，很多维系蛋白质分子二、三、四级结 构的次级键断裂，蛋白质的空间结构改变，多肽链由 卷曲而伸展。展开后的多肽链表面的静电荷变稀、胶 粒间的吸引力变大，互相靠近，并通过分子间的疏水 基和巯基形成分子间的疏水键和二硫键，使胶粒之间发 生一定程度的絮结，胶凝能力增强，而前凝胶［２］ （ 熟豆 浆） 的体系黏度较之生豆浆有明显增加，相应的大豆蛋 白溶解性明显下降，这就是大豆蛋白溶解和胶凝之间的 冲突。
在实验条件下测得的两种酶的酶活见表 ２ 。
表 ２ 两种蛋白酶酶活 Table 2 Activity of two proteinases
酶活测定条件
蛋白酶
ｐＨ
温度（℃）
Ａｓ １．３９８（固体粉末）
４０
Ａｌｃａｌａｓｅ（液体）
７．０
６０
酶活（Ｕ／ｇ ｏｒ Ｕ／ｍｌ）
收稿日期：２００５－０２－２６ 基金项目：“十五”科技攻关项目（ ２ ０ ０ １ Ｂ Ａ ５ ０ １ Ａ １ ８ ） 作者简介：孙欣（ １ ９ ６ ３ － ） ，女，高级工程师，研究方向为大豆食品研发。
38 2005, Vol. 26, No. 12
食品科学
※基础研究
酶
Ａｌｃａｌａｓｅ Ａｓ １．３９８