重组人促红细胞生成素

临床上EPO不仅用于治疗肾性贫血，而且已经被应贫血的治疗8]。尽管输血由于起效快、价格低等有利因素在临床治疗中被广泛应用，但是它也存在诸多潜在危险，如感染、输血反应，严重时甚至引起死亡。而注射EPO则能有效地避免这些输血并发症。

1985年，人们运用重组技术[9表达了重组人红细胞生成素(rHuEPO)。

rHuEPO 生产细胞株CHO2EPO C2

重组人红细胞生成素( rHuEPO) 是利用基因工程技术,将人的红细胞生成素基因转入哺乳动物细胞内,高效表达的能刺激红细胞生成的糖蛋白激素,用于治疗慢性肾功能衰竭和癌症化疗产生的贫血[122 ]

[1 ] Oh J H ,Ha H , Yu M R ,et al . Sequential effects of high glucose on mesangial cell TGF2β1 and fibronectin synthesis[J ] . Kidney Int ,1998 ,

54 :187221878.

[2 ] Border WA ,Noble N A. TGF2beta in kidney fibrosis :A target for gene therapy[J ] . Kidney Int ,1997 ,51 (5) :138821396.

重组EPO(rHuEPO)

由于EPO在体内的作用巨大而天然来源却十分有限(主要从贫血患者的尿中提取)，人们便开始利用基因重组的分子，它由不同的糖化体构成，各种糖化体的区别主要表现在糖基在整个分子中所占的比例不同，而这个比例也的作用极为相似，它一方面能够刺激骨髓造血功能，及时有效地增加红细胞的数量；另一方面能够增强机体对氧的结合、运输和供应能力，有利于在高强度竞技时改善缺氧状态，促进肌肉中氧生成，使肌肉更有力、工作时间更长，从而增强运动能力。长期使用rHuEPO，对运动员来说，可能会带来一时的荣誉，但给其健康带来的却是永久的危量过度增加，当血红蛋白含量超过55％时，血液粘滞度就会增高，同时血流也会变慢。加上外界因素如运动脱水、环境压力和不合理医务监督等，当血红蛋白含量升高至65％甚至70％以上时，血流速度过慢，引起工作肌缺氧，有可能导致静脉微血栓形成，从而引起肺栓塞、中风和死亡。

目前市场销售的促红细胞生成索制剂中，虽然厂家及产品名称不同(如益比奥、生血素、利血宝等)，但其结构、功能及代谢规律均非常相似。2002年盐湖城冬奥会后，NESP作为一种新型的rHuEPO类兴奋出现。

重组技术生产的rHuEPO是一种酸性糖蛋白，分子量为29．8士0．3kDa，于1985年问世并成为注册药物。它来启动子构建成表达载体后，以不同的细胞株[有中国仓鼠卵细胞(CH0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)及C127小鼠纤维细3]作为受体进行表达，获取rHuEPO，所以rHuEPO 的氨基酸序列与正常EPO完全相同，仅糖基部分有微小差别。由此可见，rHuEPO与EPO 在结构上的不同是N-端唾液酸含量的差异[10。

Ca q-Darbepoetin也称新红细胞生成刺激蛋白(novel e—rythropoiesis stimulating protein，NESP)，其商品名为Aranesp，是一种高糖基化的rHuEPO类似物口1,123。Darbepoetin 同样能够促进红细胞的产生，并且其不良反应发生率和死亡率都与rHuEPO相似，但Darbepoetin可能引起的高血压和凝血事件比rHuEPO少。由于它与禁药目录中的EP0有同样的功效，所以同样也属于禁用药物。Darbepoetin含有5个N一糖链和比rHuEPO多的唾液酸残基这两个额外的、包含硅酸的N一多糖链按顺序被放在EP0肽链主干的氨基酸位置上，既不改变蛋白质的结构，也不影响与受体的结合。Darbepoetin的分子量(36．8±0．4kDa)比rHuEPO 大，其糖基含量也由40％增加到52％[13J“。由于糖基含量的增加，它的半衰期(t。／2)比rHuEP0延长2倍，体内的药效作用时间更长久。并且，Darbepoetin有较好的代谢稳定性和较长的半衰期，持续时间比10倍剂量的rHuEPO还要长，所以可以延长给药的时间间隔，减少给药次数口“，是临床用药的又一重大突破。

检测

1990年，LeifWide[18,19通过研究发现虽然rHuEPO的氨基酸序列与天然EPO完全相同，但rHuEPO带的电荷与内源性EPO有所不同，这可能是因为糖化度及唾液酸化度略有区别。因此，rHuEPO与内源性EPO(huEPo)的电泳行为会有所差别，这就给凝胶电泳法分离rHuEPo和huEPO 带来了可能。

2000年，法国国家反兴奋剂实验室的Francoise建立了等电聚焦配合以化学发光为指示剂的免疫印迹法检测外源性EPO的方法。由于rHuEPO带更多的负电荷，所以rHuEP0在等电聚焦电泳中会出现附加的碱性条带，而内源EPO则没有。通过与标准品和内源性EPO条带的对比，就可以进行判定。Lanse实验的具体方法是：聚丙烯酰胺凝胶(7M尿素，5％丙烯酰胺，3％胶联剂，Icm厚)中加入pH值为2～4、4～6的两性电解质11：1加入，使最终浓度为2％(w／v)]形成pH梯度。样品通过上样滤纸片上在凝胶的阴极附近[每份样品中包含1％(v／v)Tween80]。首先，没有上样前胶在250V、1mA／cm、lW／am的条件下预聚焦30min(8℃)。上样走胶条件为：2000V，lmA／cm，1W／cm到4000Vh[阳极液为0．5M磷酸溶液，阴极液为2％(w／v)的6～8的两性电解质]。电泳完成后，通过半干法转印技术(0．8mA／cm2)将凝胶上的蛋白质转印到PVDF膜上，用25mMTris／192mMglycine的溶液作为转印缓冲液。转印完毕后，将膜放在

5raMDTT／PBS溶液中温浴1h，使EPO分子中的二硫键断裂开。用PBS漂洗膜，再放入5％低脂奶粉的PBS溶液中封闭1h，PBS溶液漂洗(33min)，漂洗后将结合在膜上的抗体再次转印到第二张PVDF膜上(0。7％醋酸，0．8mA／cm2)，同样用5％低脂奶粉的PBS溶液封闭1h，然后加入二抗反应1h。再用0．5％的低脂奶粉的PBS溶液漂洗(33min)，最后将膜放入辣根过氧化物酶中反应1h，用PBS漂洗33min后用化学发光检测仪检测，条带清晰可见(20)。

1]郭葆玉．基因工程药学．上海：第二军医大学出版社，

[2]Jacohsgenomicerythropoietin．Nature，1985，313(28)：806—810。

[3]卢庄，蔡耘，钱小红．肽类兴奋剂检测技术进展．中国运动医学杂志，2004，23(5)：537—545．

[4]LaiR，Wangerythropoietin．J

[5]TsudaMMurakamia1．Comparativestudyoligosaccharidesurinaryerythropoietins．Bi ochemistry，1988，27：5646[63M，TakasakiS，

Miyazakia1．Comparativestudyasparagine-linkederyth—

ropoietinspurified[7]DavisJM，ArakawaTw，eterythropoietinproducedcells．Biochemistry，1987，26：2633[8]赵长安，李恩．红细胞生成素的研究进展．中华血液学杂志，1993，14(5)；270—271。

[6 Takeuchi M，Takasaki S，Miyazaki H，et a1．Comparativestudy of the asparagine-linked sugar chains of human eryth—ropoietins purified from urine and the culture medium of re—combinant hinese hamster ovary cells．J Biol Chem，1 988，263：3657—3663．[7]Davis JM，Arakawa T，Strickland Tw，et a1．Character—

ization of recombinant human erythropoietin produced in

Chinese hamster ovary cells．Biochemistry，1987，26：2633—2638．

[8]赵长安，李恩．红细胞生成素的研究进展．中华血液学杂志，1993，14(5)；270—271．

[9]PescheleM．Biogenesiserythropoietin；pro-erythropoietinkidney．Science，1975，190：910．

[10]StonrringPL，TipladyPd，GainesRE．Lectin-bindingerythropoietin：

compari-urinaryerythropoietins．Endocrinol，1996，150(3)：401—412．

[11]NissensonerythropoiesisstimulatingproteinmanagingkidneyKidneyDis。2001，

38(6)：1390—1397．

[12]EgneJC，BrowneJK．Developmenterythropoietinstimulatingprotein(NESP)．BrCancer，