7蔗糖酶的制备和活力测定

以零号管调零，测520nm光密度。以葡萄糖含量为横坐标， 以光密度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线
酶活测定 （保留原管酶液，每管均设对照）
试剂 ml
管号
测定管
级分I
级分II
对照管
级分I
级分II
0.3M 蔗糖溶液
0.6
0.6
0.1M醋酸缓冲液
0.2
0.2
H2O
1.1
1.1
25பைடு நூலகம்水浴3min
酶(1:10, 1:50,1:100,1:200)
蔗糖酶的活力 比活力=
1ml蛋白质的含量 5、乙醇沉淀后的固体蔗糖酶（分装两支1.5ml离心管中，4℃保
存，备用）
思考题
• 比活力的概念和酶纯化过程中测定比活力 的含义。
• 比较级分I和级分II的比活力，试分析级分 II比活力高的原因。
实验七
蔗糖酶的制备和比活力的测定
比色法测酶活性的原理
• 在蔗糖酶催化下，蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖,最适 pH值为3.5-5.5。
• 通过测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖酶的 活力，同时测定蛋白含量，从而求得酶的比活力。
• 酶活力单位（U）：在特定条件下反应1min,每产生1mmol 底物所需要的酶量，或是转化底物中1mmol的有关基团的 酶量。实际是1ml 酶液所产生底物的量定为1ml酶液的活力
Ø 样品 0.5ml + 考马斯亮蓝染液 5ml，室温5min， 测OD595
样品：1. H2O
2. 级分I （1:10） 6. 级分II
3. 级分I （1:50）
（1:10）
4. 级分I （1:100） 7. 级分II
5. 级分I （1:200） （1:50）
Ø 参照蛋白质浓度标准曲线(预制)8，. 级计分算I出I 各级分蛋白质含量。 （1:100）
管号
试剂 ml
0
标准糖溶液 1mg/ml 0
0.1M醋酸缓冲液 0.2
dH2O
1.8
1
2
0.2 0.4 0.2 0.2
1.6 1.4
3
4
5
0.6 0.8 1.0 0.2 0.2 0.2
1.2 1.0 0.8
二硝基水杨酸溶液
2
2
2
2
2
2
混匀，沸水浴 5min，流水冷却3min 测定前，每管加 9ml H2O
y=0.0093x 9. 级分II
X代表溶液的浓度（mg/ml），Y代表595nm下的吸收值 （1:200）
实验结果
1、葡萄糖浓度的标准曲线 2、级分I和级分II中的蔗糖酶的活力。
（每 1ml蔗糖酶溶液产生的葡萄糖量） 3、级分I和级分II中蛋白质的含量（每1ml 所含的mg） 4、计算级分I和级分II蔗糖酶的比活力：
• 酶的比活力: 每mg酶蛋白质所具有的酶活力
实验内容
1. 酵母蔗糖酶的制备 2. 各级分酶溶液活性的测定
（1）葡萄糖标准曲线的制备 （2）蔗糖酶水解蔗糖后还原糖含量的测定
3. 各级分蔗糖酶溶液蛋白质含量的测定 4. 各级分蔗糖酶溶液比活力的计算
蔗糖酶制备的原理
• 酵母中的蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外 侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的,称之为外蔗糖 酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖 成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内 蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为 双亚基，二聚体,外酶约为27kDa(或22 kDa，与酵 母的来源有关)，内酶约为13.5kDa。
② 热抽提（级分II）：
目的：去除不耐热的蛋白杂质
50℃热处理30分钟（摇），冰浴、离心后将上清转移到烧
杯中，取1.5ml作为级分II。剩余进行乙醇抽提。
此时可以开始测比活力
③ 乙醇抽提（级分III）： 目的：抽提能被乙醇沉淀的蔗糖酶
乙醇沉淀离心后的固体蔗糖酶，等量分装在两个1.5ml的 EP管中，4℃保存，做为下两次实验中的酶
上清转入离心管中，50 ℃水浴30min 平衡后离心10min，4℃,10000rpm 上清转入小烧杯，取1.5ml用于测定酶活力和蛋白质含量 级分II 其余加入等体积预冷95%乙醇，搅拌均匀后放置10min
平衡后离心10min，4℃,10000rpm。沉淀分装到两个EP管中。
葡萄糖标准曲线的制备
酶分离提纯的总目标是提高回收率及纯度，保持较高 的酶比活力（低温操作）
称取10g酵母和5g二氧化硅，放入研钵中
加预冷蒸馏水30ml，分多次加入，每次5ml，研磨30min
分装入两个离心管中，平衡后离心15min，4℃,10000rpm
上清再次同样条件离心 级分I
上清测pH，用1M乙酸调pH至5.0，取出1.5ml用于测定酶活力和蛋白质含量
• 两种酶底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此， 本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少， 极难提取，本实验采用研磨水抽提，提取纯化的主 要是外酶。
制备蔗糖酶（教材p158/76）
① 研磨水抽提（级分I ）： 目的：提取酵母水溶性蛋白成分
研磨、离心、调pH为5，取 1.5ml作为级分I。剩余做热抽提。
0.1
25℃水浴5min
二硝基水杨酸试剂
2
2
酶(1:10,1:50,1:100,1:200)
0.1
混匀，沸水浴 5min，流水冷却3min 测定前，每管加 9ml H2O
以标准曲线的“0”管调零，测520nm光密度值。以测定管的光密度值 减去对照管光密度值，求得的差值从标准曲线上查得相应的葡萄糖含
蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝方法）