基因克隆简介
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基因克隆简介
1.4 II类限制性内切酶
首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流 感嗜血菌中分离出来。
分离的第一个酶是 Hind Ⅱ
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多 数是回文序列）。 与DNA的来源无关。
基因克隆简介
（2）切割位点
从识别位点处
切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或 平齐末端（blunt end）。如：
基因克隆简介
❖ 载体具以下特征：
❖ 1) 具有自主复制能力； ❖ 2）有可选择的标记基因（如，抗药基因） ❖ 3）有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一
切点； ❖ 4）分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入
宿主细胞并在其中增殖；被切割后的载体，插入外 源DNA后，不影响其复制能力 5）使用安全。克隆载体应只存在有限范围的宿主， 在体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状， 并且不能离开宿主自由基因扩克隆散简介。
限制性内切酶
能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来 DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称 为限制性核酸内切酶。
基因克隆简介
1.2、限制性核酸内切酶的命名原则
限制酶的命名是采用Smith和Athens提议的方案， 即名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母 ，大写；第2Leabharlann Baidu3二个字母取自它来源细菌的种名的头 2个字母，小写；如果它的来源菌还有株系，则有第4 个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同 限制酶的编号。前三个字母用斜体表示。
基因克隆简介
基因克隆简介
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把 两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 基因克隆简介
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
多克隆位点
polylinker
复制起始点 ori
5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
基因克隆简介
-3’ -5’
-3’ -5’
（4）粘性末端的意义
①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
基因克隆简介
Escherichia
Coli Ry13
EcoR I
属名
种类 株系
编号
若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的 第一和第三个字母。
如Hind Ⅲ代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzac) d株中分基离因克到隆简的介第3个限制酶。
1.3、限制性核酸内切酶的分类
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰 活性等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。 I 类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。 Ⅱ类：基因工程的工具酶。 Ⅲ类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点 25 bp～27 bp，对分子克隆操作亦无实用意义。
基因克隆简介
一个完整的基因克隆过程包括以下步骤
❖ １.获得待克隆的DNA片段（基因）； ２.目的基因与载体在体外连接； ３.重组DNA分子导入宿主细胞； ４.筛选、鉴定阳性重组子； ５.重组子的扩增与／或表达。
基因克隆简介
➢ 1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因 的DNA片段。
➢ 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自 我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重 组DNA分子。
基因克隆简介
基因克隆简介
一. DNA分子克隆的基本原理
❖ 基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组 ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源 的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合 分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成 大量的子代DNA分子的过程。
❖ 克隆（clone）一指含有单一的DNA重组体的无性 繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性 繁殖系的过程(cloning)。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
基因克隆简介
基因克隆简介
2. 连接条件
（1）必须是两条双链DNA。 （2）DNA3’端有游离的-OH，
5’端有一个磷酸基团（P）。 （3）需要能量
动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+
基因克隆简介
三. 分子克隆的载体
基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一 段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入 外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。
EcoR I 5’-GAATTC-3’ EcoR V 5’-GATATC-3’
3’-CTTAAG-5’
3’-CTATAG-5’
Pst I 5’-CTGCAG-3’ Sam I 5’-GGG CCC-3’
3’-GACGTC-5’
3’-CCC GGG-5
产生粘性末端 基因克隆简介
产生平齐末端
（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。
➢ 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称 寄主细胞）并与之一起增殖。
➢ 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组 DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的 目的基因。
➢ 5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞， 使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人 类所需要的物质。
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二. 用于基因克隆的工具酶
基因克隆简介
1. DNA限制性内切酶
1.1、限制酶概念提出的背景
20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体 不能交叉感染，如E coli K株的噬菌体只能感染E coli K株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“ 限制现象”。
1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象 。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是 核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位 ，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，另 一种是修饰酶，可对自生基因的克隆D简N介A进行修饰。
1.4 II类限制性内切酶
首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流 感嗜血菌中分离出来。
分离的第一个酶是 Hind Ⅱ
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多 数是回文序列）。 与DNA的来源无关。
基因克隆简介
（2）切割位点
从识别位点处
切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或 平齐末端（blunt end）。如：
基因克隆简介
❖ 载体具以下特征：
❖ 1) 具有自主复制能力； ❖ 2）有可选择的标记基因（如，抗药基因） ❖ 3）有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一
切点； ❖ 4）分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入
宿主细胞并在其中增殖；被切割后的载体，插入外 源DNA后，不影响其复制能力 5）使用安全。克隆载体应只存在有限范围的宿主， 在体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状， 并且不能离开宿主自由基因扩克隆散简介。
限制性内切酶
能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来 DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称 为限制性核酸内切酶。
基因克隆简介
1.2、限制性核酸内切酶的命名原则
限制酶的命名是采用Smith和Athens提议的方案， 即名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母 ，大写；第2Leabharlann Baidu3二个字母取自它来源细菌的种名的头 2个字母，小写；如果它的来源菌还有株系，则有第4 个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同 限制酶的编号。前三个字母用斜体表示。
基因克隆简介
基因克隆简介
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把 两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 基因克隆简介
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
多克隆位点
polylinker
复制起始点 ori
5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
基因克隆简介
-3’ -5’
-3’ -5’
（4）粘性末端的意义
①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
基因克隆简介
Escherichia
Coli Ry13
EcoR I
属名
种类 株系
编号
若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的 第一和第三个字母。
如Hind Ⅲ代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzac) d株中分基离因克到隆简的介第3个限制酶。
1.3、限制性核酸内切酶的分类
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰 活性等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。 I 类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。 Ⅱ类：基因工程的工具酶。 Ⅲ类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点 25 bp～27 bp，对分子克隆操作亦无实用意义。
基因克隆简介
一个完整的基因克隆过程包括以下步骤
❖ １.获得待克隆的DNA片段（基因）； ２.目的基因与载体在体外连接； ３.重组DNA分子导入宿主细胞； ４.筛选、鉴定阳性重组子； ５.重组子的扩增与／或表达。
基因克隆简介
➢ 1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因 的DNA片段。
➢ 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自 我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重 组DNA分子。
基因克隆简介
基因克隆简介
一. DNA分子克隆的基本原理
❖ 基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组 ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源 的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合 分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成 大量的子代DNA分子的过程。
❖ 克隆（clone）一指含有单一的DNA重组体的无性 繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性 繁殖系的过程(cloning)。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
基因克隆简介
基因克隆简介
2. 连接条件
（1）必须是两条双链DNA。 （2）DNA3’端有游离的-OH，
5’端有一个磷酸基团（P）。 （3）需要能量
动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+
基因克隆简介
三. 分子克隆的载体
基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一 段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入 外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。
EcoR I 5’-GAATTC-3’ EcoR V 5’-GATATC-3’
3’-CTTAAG-5’
3’-CTATAG-5’
Pst I 5’-CTGCAG-3’ Sam I 5’-GGG CCC-3’
3’-GACGTC-5’
3’-CCC GGG-5
产生粘性末端 基因克隆简介
产生平齐末端
（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。
➢ 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称 寄主细胞）并与之一起增殖。
➢ 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组 DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的 目的基因。
➢ 5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞， 使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人 类所需要的物质。
基因克隆简介
基因克隆简介
二. 用于基因克隆的工具酶
基因克隆简介
1. DNA限制性内切酶
1.1、限制酶概念提出的背景
20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体 不能交叉感染，如E coli K株的噬菌体只能感染E coli K株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“ 限制现象”。
1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象 。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是 核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位 ，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，另 一种是修饰酶，可对自生基因的克隆D简N介A进行修饰。