细菌鉴定方法

一淀粉水解试验

（一）实验原理

细菌对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶将大分子物质分解。胞外酶能分泌扩散到细胞外，将物质分解成小单位如糖、氨基酸、甘油与脂肪酸。这些小单位的物质能被细菌吸收和利用。水解过程可通过底物的变化来证明，如细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色；水解明胶可观察到明胶被液化；脂肪水解后产生脂肪酸改变培养基的pH，其中的中性红指示剂使培养基从淡红色变为深红色。

（二）实验方法

将淀粉培养基溶化后，冷至45℃左右，以无菌操作制成平板。

取18-24h的纯培养物点于平板上，每皿可点种3-5个菌株，适温培养2-4d，形成菌落后，在平板上滴加卢戈氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板成蓝色。如果菌落周围有无色透明圈出现，说明淀粉已经被水解，实验为阳性，否则为阴性。透明圈的大小一般说明水解淀粉的能力。

（三）实验试剂的配制

肉汤蛋白胨琼脂成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2。

淀粉培养基制法：在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2％的可溶性淀粉，校正pH 值至7.6，分装三角瓶，121℃20min灭菌备用。

卢戈氏(Lugol)碘液：碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，混匀，定容。

二糖发酵试验

(一)实验原理

单糖发酵是将葡萄糖，乳糖或麦芽糖等分别加入蛋白胨水培养基内，使其最终浓度为0.75-1％。并加入一定量酚红指示剂及小倒管，制成单糖发酵管，接种细菌经37℃培养18-24小时，若能分解糖产酸则酚红指示剂由红变黄，若能分解甲酸有CO2和H2等气体形成，小倒管内则聚集有气泡；不分解，则指示剂不变色。

(二)实验材料

1．菌种：大肠杆菌，伤寒杆菌18-24小时琼脂斜面培养物。

2．培养基：葡萄糖发酵管，乳糖发酵管等。

(三)实验方法

1．将伤寒杆菌，大肠杆菌按照液体接种方法分别接种于葡萄糖及乳糖发酵管内。2．置37℃孵箱培养18-24小时。

3．观察结果：由于一些细菌能分解某种糖类产酸，所以培养基中pH下降到7.0以下，在酚红指示剂的显示下，培养基颜色由红变黄。产酸者以“+”表示，如果同时产生气体，则培养基中小倒管内有气泡出现，此乃产酸又产气，以“⊕”表示，不分解，则指示剂不变色，用“-”表示。

(四)实验结果

伤寒杆菌大肠杆菌

葡萄糖+ ⊕

乳糖- ⊕

(五)实验试剂的配制

1.单糖发酵管的制备：成分：蛋白胨水培养基100ml ，0.2%酚红1ml ，所需糖（葡萄糖或乳糖）0.75-1g

制法：

（1）将上述成分溶化，混匀分装于内含有倒置小玻璃管的小试管中，每管约2ml，加塞。

（2）小倒管排气，灭菌（8-10磅，20-30分钟），贮存备用。

用途：供单糖发酵试验用。

2.0.2%酚红配制法

酚红（phenol red）0.2g ，0.lmol/LNaOH 8ml ，蒸馏水92ml

将酚红入研钵徐徐加入0.lmol/LNaOH研磨，再补足蒸馏水即成。若需长时间保存，可高压灭菌后贮存备用。

三甲基红（M.R）试验

(一)实验原理

某些细菌如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，继而分解为甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH值降至4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，此为阳性反应；若产酸量少或产生的酸进一步转化为醇、醛、气体和水等，则培养基的酸碱度仍在pH 6.2以上，加入甲基红指示剂呈现黄色，为阴性反应。

(二)实验材料

1. 菌种：大肠杆菌，产气杆菌18-24h琼脂斜面培养物。

2. 培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。

3. 试剂：甲基红试剂。

(三)实验方法

1. 分别将大肠杆菌，产气杆菌接种于两支葡萄糖蛋白胨水培养基中。

2. 置37℃培养2-3天取出，分别滴加甲基红试剂2-3滴，混匀，观察结果。

(四)实验结果

大肠杆菌：+，产气杆菌：-。

(五)实验试剂的配制

1．甲基红试剂的配制

甲基红0.04g，95%酒精60ml ，蒸馏水40ml 。

先使甲基红溶解于酒精中，再加入蒸馏水，混合，摇匀即成。

2.葡萄糖蛋白胨水培养物

成分：蛋白胨5g 葡萄糖5g

制法：

（1）将上述成分溶解于蒸馏水中。

（2）调节pH至7.6，用滤纸过滤除渣。

（3）分装中试管，每管约3-4ml，灭菌后备用。

用途：供甲基红及V-P试验用。

四产吲哚（indole）试验

(一)实验原理

某些细菌如大肠杆菌，变形杆菌等具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水培养基中的色氨酸，产生靛基质（无色吲哚），再与欧立希试剂（对二甲基氨基苯甲醛）反应，形成红色化合物—玫瑰吲哚，即为阳性反应。

(二)实验材料

1. 菌种：大肠杆菌，伤寒杆菌18-24小时琼脂斜面培养物。

2. 培养基：蛋白胨水培养基。

3. 试剂，欧立希（Ehrlich）试剂（对二甲基氨基苯甲醛）

(三)实验方法

1. 分别将大肠杆菌，伤寒杆菌接种于两支蛋白胨水培养基中。

2. 置37℃培养2-3天后，每管沿管壁各加欧立希试剂0.5-1ml于培养液面上，待1-2分钟后观察结果：在交界面出现玫瑰红色环即为吲哚试验阳性，无红色环即为阴性。

(四)实验结果

大肠杆菌：+ ；伤寒杆菌：- 。

(五)实验试剂的配制

1.蛋白胨水培养基的制备

成分：蛋白胨10g 氯化钠5g 蒸馏水1000ml

制法：

（1）先用少量蒸馏水将蛋白胨和氯化钠相混合溶解,再加足蒸馏水量。

（2）调节pH至7.6、用滤纸过滤。

（3）分装中试管，每管约3-4ml，加塞灭菌后备用。

2. 欧立希（Ehrlich）试剂的配制

对位二甲基氨基苯甲醛4g

95%酒精380ml

浓硫酸或浓盐酸80ml

三种成分混合即成，瓶口要严密，以免挥发。

五硝酸盐还原试验

(一)硝酸盐还原试验原理：

硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。但硝酸盐还原的过程因细菌不同而异，有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌；有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞菌等。硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝酸盐。

(二)培养基：

硝酸盐培养基。

(三)试剂：

甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100ml）；乙液（α-奈胺0.5g + 5mol/L 醋酸100ml）。