体内药物分析-第三章-生物样品与样品制备..

洗脱
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Ⅱ：大孔吸附树脂
特点：具有较大的比表面积、吸附容量大、可反复 使用、价格便宜、最常用的是非极性、一般用乙 醇－水或甲醇－水即可解吸待测物质、加入适量 的无机盐有助于吸附
预处理：用乙醇浸泡除去杂质（或用酸碱泡），并 使其充分溶涨，在用水洗去有机溶剂后使用。
注意事项：树脂要保持湿润
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Ⅲ：离子交换树脂
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2、固相萃取( Solid phase extraction, SPE)
（1）原理 根据液相萃取的原理，利用液相中溶质与吸附剂
间的选择性吸附与洗脱原理。当液相流经吸附剂后 ，一些小分子药物被吸附，经适当洗涤除去杂质， 再用少量溶剂洗脱，可达到分离、纯化目的。 决定因素：药物与固定相表面的活性基团、药物与溶 剂分子间的分子间作用力
～3000r／min离心5min →上清液即为血浆。 血清的制备 血样→室温放置30min到1h →出现血饼→剥去血
饼→以2000r/min～3000r/min离心5min～ 10min →分取上清液即为血清
当血浆中含有的抗凝剂对药物浓度有干扰时，使用血清样品 4
肝素的加入： 1ml血液/需要肝素0.1～0.2mg，通常不需 准确加入，在取血前可取少量肝素钠溶液（ 1～2滴）置于试管内，旋转试管，使肝素溶 液均匀分布于试管壁上，干燥后加入血样后 立即轻轻振摇即可。
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洗脱方式：
（1）药物与固定相的亲和力>杂质与固定相 的亲和力－先被保留后解吸
（2）药物与固定相的亲和力<杂质与固定相 的亲和力－直接洗脱
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可弃性柱、操作步骤少、使用溶剂少
、节省实验费用和时间
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（2）SPE固相选择的原则－固定相与被测组分应具 有相似的极性，含有被测组分的样品应使用极性相 反的溶剂溶解后上柱，而用与被测组分相似极性的 溶剂洗脱
总的流程图：
必要时调pH值
血浆或其他生物样品
加入萃取溶剂
分取有机层
流动相溶解后进样分析
减压氮气吹干
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消除LLE中产生的乳化现象：
1、提取前在水相中加入适量的固体食盐 2、经适当转速离心消除已产生的轻微乳化 3、置于冰箱中快速冻凝破坏乳化层，再融化后离
心来消除已产生的严重乳化现象
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LLE的两种特殊萃取方法： 离子对提取法（Ion-pair extraction) 提取烷基法（Extractive alkylation）
2、碱性药物（亲脂性）→大孔吸附树脂 3、亲水性强可离解的药物→离子交换树脂 4、亲水性强不可离解的药物→沉淀蛋白后进样
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（4） 各萃取方法之间的比较
SPE 方 法 间 的 比
较
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SPE方法的优点：
1、引入的杂质少 2、可以完全避免乳化的形成 3、有较高的萃取回收率，重现性好 4、小柱可弃，没有污染 5、需要的样品量少 6、洗脱溶剂多为水溶性的，易于实现自动化
Ⅰ→亲脂性键合相硅胶（C18、反相硅胶） Ⅱ→大孔吸附树脂（苯乙烯与二乙烯苯共聚物） Ⅲ→离子交换树脂 Ⅳ→亲水型填料（硅藻土、正向硅胶）
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（3）SPE方法建立－以亲脂性键合硅胶为例 1、以甲醇润湿小柱，活化填料，甲醇含量8％ 2、用水或缓冲液冲洗小柱，洗去多余的甲醇 3、上样，弃去废液 4、用水或缓冲液冲洗小柱除去水溶性杂质 5、用合适的洗脱剂洗脱小柱，收集洗脱物 6、回收溶剂后进行分析和监测
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全血：血液置于抗凝管中，不经离心操作，冷冻储存 或直接分析 需要测定分布于血细胞内、外的药物浓度 如果血浆内药物浓度波动较大并难以控制 血浆药物浓度很低凝影响测定
血样的特点： 缺点：损伤性采样方式、样品量受限、抽血比较麻烦 优点：可用于药物动力学、生物利用度、临床治疗药
物监测 大多数测定的时原型药物总量
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1、液－液提取法（LLE） 大多数药物都是脂溶性的，内源性物质 基本上都是水溶性的，当用有机溶剂萃取 时，药物被萃取出来而内源性物质被除去 ，因此采用有机溶剂萃取法能够达到纯化 的目的。
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关键要考虑三个方面的因素： （1）有机溶剂的特性 （2）有机溶剂相和水相的体积 （3）水相的pH值
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选择溶剂应注意的问题：
（1）了解药物与溶剂的化学结构及性质，根据相似相溶来
选择
溶 剂
（2）要求对分子型药物易溶，离子型药物不溶
的 选
（3）沸点低、易挥发和浓缩
择 （4）要与水不相溶 与
纯 （5）无毒、不易燃
度 要 （6）不易乳化
求 （7）具有较高的化学稳定性和惰性
（8）不影响检测
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2、有机相和水相的体积：一般为1:1～1:2
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实验中的注意事项
1、体液样品可直接上柱，上样体积在0.1～2.0ml 2、洗脱流速在1～2ml/min 3、萃取介质中含有少量的甲醇可以提高萃取率 4、萃取碱性药物时，常需在洗脱机中加酸、有机胺
、醋酸铵或离子对试剂 5、选用苯基和氰基柱时，需用极性溶剂如丙酮洗脱 6、选用反相硅胶柱时，少量的甲醇和乙腈即可完成
3、水相的pH值：碱性药物→pH>pKa+1～ 2
酸性药物→pH＜pKa+1～2
4、提取次数：往往进行的是一次萃取，个别 情况下可以对分离出的含药有机相用一定的 pH水进行反萃取（Back extraction)
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优点：选择性；药物能与多数内源性物质分离
缺点：乳化、有毒、不环保、不自动，对极性大 的化合物的萃取效率低
完，不能反复冷冻→解冻→冷冻(FTC)；样品应以小 体积分装存放。
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第二节 生物样品的预处理与制备
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一、预处理目的
（一）药物从缀合物中释放，测定总浓度 （二）纯化、富集药物 （三）适应和满足测定方法要求的灵敏度 （四）防止对分析仪器的污染和劣化
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二、样品制备时应考虑的问题
（一）药物的理化性质、存在形式和浓度范围 （二）药物测定的目的 （三）生物样品种类和杂质干扰类型 （四）样品的化学组成 （五）药物的蛋白结合率 （六）被测组分在预处理过程中的稳定性 （七）样品在收集、储存等过程中容器的污染 （八）样品的预处理过程要求简便 （九）预处理的最后一步应富集被测组分 （十）对分析方法的要求
操作：上样到亲水性固定相表面→用与水不相混溶的 有机溶剂洗脱目标化合物→强亲水的蛋白质等保留 在固定相上。
注意事项：
1、硅胶填料→先用甲醇和水处理后上样
2、硅藻土/棉纤维→直接上样，不需清洗并可再生
3、样品萃取无浓集作用，萃取体积大，样品较干净
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萃取方法的选择
1、亲脂性药物→LLE、反相硅胶、大孔吸附树脂、亲 水性填料
5、SDS洗涤
6、甲醇
都需要反复清 洗2～3次
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毛发样品的制备
1、直接甲醇提取 2、酸水解 3、碱水解 4、酶水解 5、超临界流体萃取 6、有机破坏
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二、生物样品的贮存与处理
（一）冷藏或冷冻 1、血浆和血清：采血后及时分离（2h），短期4℃，
长期-20℃ 2、尿样：应立即测定，否则需加防腐剂置冰箱保存 3、唾液：在4℃下保存，往往需要在取样时测定pH值 4、生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测
2、唾液的保存与处理：取样后，除去泡沫，分层后离心，取上清 液冻存或直接分析。
3、优点：（1）非损伤性取样，（2）可用于药代动力学研究， （3）不受采血时间和地点限制，（4）样品易收集，病人易接 受
4、应用：（1）在TDM中的应用
根据S/P分类，S/P＜1.0表示药物在唾液中的浓度很低；S/P
＝1.0表示适合药物的监测；S/P不固定表示药物显著转移到了
含量低的样品 5、三种方法得到的都是药物的总量
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自动化SPE技术的优点和缺点
（1）节约时间
优 （2）平行操作带来了高的工作效率 点 （3）减少了操作误差，提高准确度和精确度
（4）安全性好 （1）残留物对测定有干扰
缺 点 （2）要考虑样品的物理或化学性质的稳定性对样
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三、样品的预处理技术
（一）经有机破坏的方法
1、湿法破坏
2、干法破坏
硝酸－高氯酸法
高温电阻炉灰化法
电热消化器法
低温等离子灰化法
电热板消化法
烘箱消化法
3、氧瓶燃烧法
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（二） 去除蛋白质
1、溶剂解法
常用溶剂（与水相混溶的有机溶剂）： 乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、 丙酮、四氢呋喃 体积比：1：1～3 90％去除 方法：超速离心（10000r/min）
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(二) 尿液
1、尿药测定用途：药物剂量回收研究、药物尿清 除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、 预测药物的代谢过程和代谢类型
2、尿的采集：非损伤性采样方式、药物浓度较高 、收集量较大、收集方便，易受食物、饮水等影 响。
3、尿样的保存与处理：
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(三)唾液
1、唾液的采集：漱口后15min进行，采集时间为10min，采用 一些物理或化学方法刺激唾液分泌；（1）缩短采样时间，（2 ）减小唾液pH变化范围，（3）刺激后得到的唾液其唾液－血 浆分布比例的个体差异较小。
缺点：样品的预处理繁琐、干扰多、药物的含量低 、需要精密仪器
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特点： 广谱性 积累性 稳定性 依时性 相关性 指纹性
一般在枕部采取样本，国外一般 在靠近头皮处剪取，分别于6～10 处取10个样本，从根部剪断，超 过12cm的均按照12cm处剪断
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头发洗涤
1、丙酮－水－丙酮
2、丙酮预洗→洗洁精洗涤 头 发 3、洗衣粉浸泡 的 预 4、二氯甲烷 洗
第三章 生物样品与样品制备
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【大纲要求】
1、掌握生物样品的种类及其特点 2、掌握生物样品的各种预处理方法的原
理及其应用
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第一节 生物样品的种类、采集、 制备与贮存
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一、种类、采集和制备
(一) 血液(Whole blood, Plasma, Serum) 1、血样采集 2、血样制备 不能作为作用部位药物浓度的可靠指标 血浆的制备 血液→含有抗凝剂的试管→混合→ 2500r／min
体积比：1：0.6 90％去除 方法：超速离心（10000r/min）
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其他去除蛋白的一些方法 1、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 2、超滤法 3、酶水解法 4、加热法
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（三） 分离、纯化与浓集
1、液－液提取法（LLE） 2、固相萃取（SPE） 3、自动化SPE技术 4、固相微萃取（SPME） 5、膜萃取（ME） 6、微透析技术（MD） 7、超临界流体萃取（SFE）
1、对弱酸性药物→在中性或碱性条件下用阴离子 交换法萃取→用水或甲醇清洗→酸性溶液洗脱
2、对碱性药物→在中性或酸性条件下用阳离子交 换法萃取→用水或甲醇清洗→碱性溶液洗脱
离子交换树脂适用于高极性和可电离性药物的纯 化
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Ⅳ：亲水性填料
原理：分配作用，水基质样品分布于填料表面为固定 相，流动相为与水不相混溶的有机溶剂，较为亲脂 的药物从固定相转移到流动相就完成了萃取，与 LLE雷同。
47源自文库
SPE的缺点：
1、价格昂贵 2、技术要求高 3、小柱各批之间有差异 4、主子容易堵塞，影响分离效果
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3、自动化SPE技术
SPE与LLE即沉淀蛋白的比较
1、SPE萃取时间短，可自动化 2、LLE萃取达平衡的时间较长 3、二者在萃取回收率即选择性等方面，因药物与萃
取条件而变，不好比较 4、沉淀蛋白法简便、快速、回收率高，但不适合于
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（二） 去除蛋白质
2、加入中性盐
常用中性盐（置换蛋白结合的水，使蛋白 脱水而沉淀）：
饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸 橼酸盐
比例：1：2 90％去除 方法：超速离心（10000r/min）
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（二） 去除蛋白质
3、加入强酸
常用溶剂（与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀）： 10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸－钨酸混合液 、5％偏磷酸
唾液中；S/P很大表示药物的离子化程度很低
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组织
（1）匀浆化法：组织→加入水或缓冲液→匀浆→上清液 （2）沉淀蛋白法：组织→加入蛋白沉淀剂→上清液 （3）水解：组织→加入酸或碱→加热使组织液化→上清
液 （4）酶水解：组织→加入酶和缓冲液→加热使组织液化
→上清液
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头发
优点：取样方便、无损伤性、检样的掺伪的可能性 低、能对某些特定的代谢物进行测定、能了解数 月至数年用药的情况、可用于体内微量元素含量 测定、可用于临床用药、滥用药物和毒性药物的 检测
离子对提取法：是一种用有机溶剂提取离子型药物的 方法。
原理：一些酸性或碱性的有机药物在体液中呈离子状 态，成为强亲水性的带电荷离子，不易被提取出来 。当加入与药物呈相反电荷的反离子物质时，即可 成为具有一定脂溶性的离子对，用有机溶剂可萃取 出来。
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碱性药物：庚烷磺酸、辛烷磺酸、己烷磺酸等 酸性药物：四丁基铵、四乙基铵、四辛基铵 提取溶剂：氯仿、二氯甲烷