番茄的遗传转化

番茄的遗传转化

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摘要：本研究以小型番茄为试材,建立其以子叶、下胚轴为外植体的高效、稳定

再生体系及遗传转化体系。子叶外植体与农杆菌共培养后,经过诱导,根的再生，初步建立了农杆菌介导的遗传转化体系。是目前最有效的途径之一。农杆菌对植物释放的化学物产生趋化反应，向植物受伤组织集中。经共培养后，受伤部位的化学诱导物透过农杆菌的细胞膜使Ti质粒上的Vir基因活化。Vir基因产物使Ti 质粒上的T—DNA进入植物细胞，并整合到植物核基因组中。插入在T—DNA 左右边界区内的目的基因也随之整合到植物染色体上，从而使目的基因在植物细胞中得到表达。近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物中也得到了广泛应用。

关键字：番茄下胚轴子叶转化

一、实验材料、试剂和仪器设备

1.实验材料：番茄种子

2.试剂：大量元素、氯化钙、微量元素、铁盐、有机成分、琼脂、蔗糖、蒸馏水、1mol∕LNaOH、6BA、NAA、升汞、蛋白胨、酵母粉、卡那霉素、75％乙醇

3.仪器设备：天平、烧杯、量筒、移液管、药勺、称量纸、玻璃棒、吸耳球、PH 试纸、培养瓶、封口膜、橡皮筋、高压灭菌锅、电炉、标签纸、记号笔、滤纸、镊子、剪子、移液枪、枪头、酒精灯、培养皿

二、实验步骤

1.外植体的制备

(1) MS培养基母液的配制

按以下的成分与浓缩比例配制母液

大量元素50mg∕L

氯化钙50mg∕L

微量元素1 mg∕L

有机成分1 mg∕L

蔗糖30 g∕L

琼脂 6 g∕L

(2)MS培养基的配置

配制200ml的MS培养基，将所需要的试剂混合后加热溶解，用1mol∕LNaOH 调节PH至5.8，宁大勿小偏酸不凝固，然后分装到灭好菌的培养瓶中。

(3)高压灭菌

将配制好的培养基、培养瓶、无菌水、有滤纸的培养皿灭菌

(4)铺种子

打开超净工作台紫外灯照射约30min，然后关闭紫外灯，打开超净工作台的风机。先数好所需要的种子，放在一个小烧杯中，到入升汞，没过种子，五到六分钟。然后回收升汞，把无菌水倒入摇晃，用灭菌好的无菌水洗3—4次，拿镊子灭菌，要灭透。将种子放在灭好菌的有滤纸的培养皿中，吸干水。拿灭好菌冷却的镊子将种子接进灭好菌的8瓶培养基中，每瓶5—6粒，接完种子将培养基放在培养室中培养，发育一周左右。

结果：共培养12瓶种子，每瓶接种5颗种子，平均每瓶生长了4颗，萌发率为48∕60=80％。

2.工程菌的活化

(1)LB培养基的制备

根据以下配方，分别配制LB固体、液体培养基，分装后高压灭菌。

液体培养基用量：蛋白胨10g∕L 酵母粉5g∕L 氯化钠10g∕L

固体培养基用量：蛋白胨10g∕L 酵母粉5g∕L 氯化钠10g∕L 琼脂10g∕L (2)倒平板

灭菌后的LB固体培养基冷却至40℃左右，加入卡那霉素，摇匀后倒入已灭菌培养皿中，冷却备用。

(3)划线

用已灭菌的接种环从保存的原菌液取一环，在已冷却的平板上划线。封好培养皿置于28℃培养箱中培养2天。

(4)摇菌

从平板上挑取单菌落，接种到20ml附加卡那霉素的细菌培养液体培养基LB中，在恒温摇床上，于28℃，180r∕min培养至OD600为0.4—0.6，取此时菌液，按1％—2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6小时左右，OD600为0.4—0.6时即可用于转化。

3.农杆菌接到的遗传转化

(1)预培养

将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm的小块，无菌胚轴、茎切成约0.8—1cm长的切段，接种在8瓶愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下：预培养2—3天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。

结果：共培养16瓶，均没有染菌。

(2)侵染

将凝了的MS培养基加热至成液体（200ml），放在超净工作台上，冷却至40℃时，加入100ul卡那霉素和100ul头孢摇匀，均匀且迅速倒入已灭菌好的8个培养瓶中，待其凝固，将直接侵染与预培养的子叶和下胚轴分别移到培养基中。(3)共培养

将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上，在28℃按培养条件下共培养2—4天。

结果：共培养16瓶其中有3瓶污染，原因可能是①操作中带入细菌②用镊子夹的太紧了③农杆菌侵染时间过长。

(4)除菌

把共培养后的外植体转移到含有抗生素的培养基上。

(5)选择培养

将经过共培养的外植体转移到加有选择性的脱菌分化或愈伤组织诱导培养基上，进行选择培养。

结果：共培养13瓶，其中有一瓶染菌，原因是由于褐化了。

(6)继代培养

一次继代：选择培养2—3周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入相应的选择培养基中进行继代扩繁培养。结果：共培养12瓶其中有4瓶褐化了，剩下了8瓶，折合到6瓶培养基中培养。二次继代：共培养6瓶其中

(7)生根培养

将不定芽长到1cm以上时，切下并插入含有选择性的生根培养基上进行生根培养，两周左右长出不定根。