第三章 蛋白质的共价结构

第三章蛋白质的共价结构

一、蛋白质通论

（一）、蛋白质的化学组成

碳 50%

氢 7% 氧 23%

氮 16% 硫 0-3%

其它微量元素（包括磷，金属元素等，这些是蛋白质的辅助成份或修饰成份）

在这些化学元素中，氮的含量在不同蛋白质中很稳定，所以可以根据氮元素的含量测定蛋白质的含量：

蛋白质含量＝蛋白质氮× 6.25

这是蛋白质定量分析的理论基础，经典的蛋白质含量测定方法就是先测定蛋白质氮的含量，再根据上述公式计算蛋白质的含量。

（二）、蛋白质的分类

（三）、蛋白质的形状和大小

蛋白质的大小与分子量

蛋白质的分子量变化较大，从6000到1,000,000道尔顿（dolton）。蛋白质的分子量可以通过实验予以测定，通常也可根据氨基酸的数目估计：

蛋白质的分子量（dolton）＝氨基酸残基数×110

但对于结合蛋白上述公式不适应。

蛋白质的结构层次

一级结构：氨基酸序列

二级结构：α螺旋，β折叠

三级结构：所有原子空间位置

四级结构：蛋白质多聚体

1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。

介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。

(五）蛋白质的功能

1.酶

2.结构成分

3.氨基酸的贮藏

4.运输功能

5.运动

6.激素

7.免疫

8.信息传递

9.基因表达调控

二、肽

由氨基酸聚合而成的线性结构叫肽链（peptide chain)，蛋白质就是由一条或多条肽链组成。蛋白质的共价结构也即是肽链的结构。

蛋白质的共价结构有时也称一级结构。但根据IUPAC的规定蛋白质的一级结构指肽链的氨基酸顺序。

（一）、肽和肽键的结构

1.蛋白质是由氨基酸通过肽键连接起来的多肽链分子，肽键是它的连接方式。蛋白质一级结构中的另一种共价结构是二硫键。它使同一条链内或两条链间的两个巯基形成二硫键。

2.肽键的结构

3.有关肽的名称多肽，环肽，阅读方向，氨基酸残基

4.肽键的性质

刚性，反式

肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连

残基：在肽链中每个氨基酸都脱去一个水分子，脱水后的残余部分叫残基（residue), 因此蛋白质肽链中的氨基酸统统是残基形式。

（二）肽的物理与化学性质

1.带电性

短肽：酸碱性由末端的α—氨基和α—羧基和R基团的可解离基团决定，滴定曲线相似于氨基酸的滴定曲线。其中α—氨基的pK值较游离氨基酸小，α—羧基的pK值较游离羧基大，R-基团变化不大。

长肽或蛋白质中酸碱性由R-基团决定。

电荷计算：根据R基团在某一pH值时的解离状态确定；

等电点计算：同样，先写解离式，再根据pK值进行计算。

2.化学性质

α—氨基，α—羧基和R基团与游离氨基酸一样，同样有茚三酮反应，还有肽键特有的反应——双缩尿反应。

3.旋光性

短肽为各氨基酸的旋光度的综和，而长肽不等于其总和。

(三）、天然肽

有许多种生物活性：激素，抗生素等。

肽激素，α—鹅膏蕈碱，谷胱甘肽。

三、蛋白质一级结构测定

(一)、氨基酸序列分析的基本策略———重叠法

(二)、蛋白质一级结构测定的步骤

1、蛋白质的分离纯化

2、测定多肽链的数目

3、(亚基分离）

4、二硫键的拆分与保护

5、氨基酸组成分析

6、鉴定N-或C-末端残基

7、多种方法的部分水解和肽段分离

8、测序

9、重叠

10、确定二硫键的位置

1.N-末端测定

（1）二硝基氟苯（DNFB or FDNB)法；

（2）丹黄酰氯（DNS)法;

（3）苯异硫氰酸酯（PITC)法；

（4）氨肽酶（amino peptidase)法

2.C-末端测定

（1）肼解法（hydrazinolysis)法；

（2）还原法（reduction);

（3）羧肽酶（Cardoxypeptidase)法

3.二硫键的切割与保护

1、过甲酸〔performic acid〕不可逆

－CH2SO3H

2、亚硫酸分解〔Sulfitolysis〕可逆

－R1-S-S-R2 ＋ SO3- R1-S- + R2-S-SO3

3、还原＋氧化不可逆

[ 巯基乙醇，DTT ] ＋碘乙酸等

－S-CH2-COOH

4.氨基酸组成分析

1.酸水解；

2.碱水解；

3.氨基酸分析

5.肽键的专一性水解

酶水解

化学法: BrCN，NH2OH

酶法水解

6.N末端和C末端测序法

N末端：

1、Sanger法 DNFB

2、Edman法

3、Dansyl chloride/Edman组合法

4、酶降解法

C末端：

1、肼法

2、3H标记法

3、酶降解法

4、PFPA/PFPAA法

C末端的肼(hydrazine)法测定

C端的氚[3H]标记法测定

酶解法末端测序

利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase) 将肽链的氨基酸从N端(aminopeptidase)或C 端(carboxypeptidase)一个接一个游离出来，在不同时间取样进行分析，根据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判断氨基酸的排列顺序。

PFPA和PFPAA法C端测序

PFPA：pentafluoropropionic acid C2F5COOH

PFPAA：Pentafluoropropionic acid anhydride

C2F5-COOOC-C2F5 这两种物质在酸性条件下低温反应，可以从C端一个接一个地切除氨基酸，与质谱相结合就可以确定C端多个氨基酸的序列。

7.肽段氨基酸序列的测定

Edman 降解法

氨基酸的鉴定、分离纯化

Edman降解与DNS-Cl法的结合

其它方法：

1.酶解法

2.质谱法

3.根据核苷酸序列推断

质谱法

Edman循环后看分子量的变化

7.二硫键位置的确定法

1、为防止Cys跟Cys-Cys发生交换反应，先

将自由SH基封闭。

2、进行专一性部分水解

3、纸层析分离水解产物

4、气相过甲酸法切断S-S键，作第二相纸层

析

5、将迁移率发生变化的多肽进行测序

N末端和C末端的测序除了用于未知蛋白质的一级结构的研究以外，最常用于基因工程表达产物的末端分析。

四、蛋白质氨基酸序列与生物学功能的关系

（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化

1.蛋白质的同源性（sequence homology)

2.不变残基（invariant residue)

3.可变残基（varible residue)

（二）同源蛋白质的起源共同性

（三）蛋白质断裂与激活