血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程

血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程
1.目的
规范血液及骨髓标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。

2.适用范围
血液及骨髓。

3.标本
3.1标本类型血液及骨髓。

3.2 标本采集
3.2.1 采血时间抗菌药物治疗前，发热初期或高峰时抽血。

3.2.2 采血频率对怀疑菌血症的成年病人，推荐同时在不同部位采集2-3套（每套包括一瓶需氧瓶，一瓶厌氧瓶或者两套需氧瓶），对感染性心内膜炎和真菌血症则应多次采血；婴幼儿病人，推荐同时在不同部位采集2套，可不做厌氧培养。

3.2.3 采血量以培养基的1/10为宜，成人一次采血5-10ml，婴幼儿为1-2ml。

3.2.4 骨髓标本用骨髓穿刺针从髂骨采集。

3.3 标本拒收标准
3.3.1 血培养瓶破裂或有明显污染。

3.3.2 血培养瓶标识与化验申请单不符。

3.3.3 用过期的培养瓶采集标本、采血量不足等。

3.3.4 对于不合格标本，应及时通知采集人员重新留取标本。

3.3.5 标本保存采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置室温，切勿放入冰箱。

冬季血培养瓶在送检过程应采取一定的保暖措施。

4.试剂、仪器
4.1 革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、麦糠凯平板、相关生化试剂等。

4.2 BACT/ALERT 3D 或BACTEC9000全自动血培养系统、鉴定系统。

成人需氧培养瓶、厌氧培养瓶、儿童培养瓶、革兰阴性菌鉴定卡（GNI+）、革兰阴性菌药敏卡（GNS）、革兰阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰阳性菌药敏卡（GBS）、真菌鉴定卡（TBC）、药敏纸片、TTB板条等。

4.3 接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、co2培养箱等。

4.4 试剂的有效期和使用参照试剂说明书。

5. 细菌鉴定和药敏质控。

参见《质量管理程序》
6. 检验步骤
接收标本后，立即对标本进行编号、登记。

门诊病人要同时登记住址，联系电话等病人信息。

6.1 自动化培养将血培养瓶置全自动血培养仪中。

当标本有菌生长时，仪器发出阳性报警，应立即用无菌注射器抽取瓶内培养液作直接涂片革兰染色，镜检，将结果向临床医师报告，同时转种血琼脂平板，麦糠凯平板或加做巧克力平板，并进行直接药敏试验，置35°C、5%CO2培养箱培养18-24小时。

从琼脂平板上挑取菌落进行涂片染色及触酶和氧化酶试验。

革兰阳性菌和革兰阴性菌分别选用GPI及GNI 上机进行细菌鉴定和药敏试验或者做K-B法药敏试验（具体操作见《药物敏感性标准操作规程》）
6.2手工培养
6.2.1 将血培养置35°孵育箱，经18-20小时孵育在血琼脂平板或巧克力平板上盲目转种一次。

6.2.2 盲目转种后，培养瓶继续孵育至第五日，每日观察一次有无菌生长，并摇匀继续培养，下列几种情况提示有细菌生长。

根据肉眼观察，对有细菌生长迹象，取菌悬液涂片做革兰染色，同时分离培养，接种需氧血琼脂平板、麦糠凯平板或加做巧克力平板，并进行直接药敏试验，置35°C、CO2培养箱培养18-24小时。

次日纯培养再进行鉴定及药敏试验。

6.3 特殊培养
6.3.1 布鲁菌属通常将血液接种到双相血培养瓶内，
培养环境应为5%-10%CO2，35°C，每48小时观察有无细菌生长，若无细菌生长应继续培养，阴性应培养至30日后才可发出报告。

6.3.2 乏氧菌该细菌生长需要硫醇复合物和维生素B6。

在血培养基中需加盐酸-磷酸吡躲醛（0.001%）或L-半胱氨酸（0.05%-0.1%）或者皆有，否则乏氧菌不能生长。

血培养物转种血琼脂平板上，然后交叉划线接种金黄色葡萄菌，靠近金黄色葡萄菌有乏氧菌生长。

6.3.3 细菌L型在培养基中含有10%蔗糖或甘露醇时，才适合L型细菌生长。

6.3.4 心内膜炎特殊致病菌如果常规血培养72小时阴性而病人临床症状仍提示感染性心内膜炎，应提高培养基的营养或补加添加剂。

有利于分离培养要求苛刻、生长缓慢的革兰阴性杆菌，如人心杆菌、侵蚀艾肯菌、金氏金氏菌、伴放线放线杆菌、军团菌等细菌，应延长培养至2-4周，然后转种特殊的培养基。

6.3.5 结核分枝杆菌培养参见《分支杆菌属检验标准操作规程》
7. 结果报告
7.1 阳性结果报告报告通常分为三级。

7.1.1 一级报告阳性报警的血培养瓶应进行涂片革兰染色，将涂片结果电话（或其他方式）通知临床，同时记
录报告的日期、时间、内容以及接收报告人的姓名。

血培养阳性应列为危急值。

7.1.2 二级报告报告直接药敏试验结果
直接药敏试验，将血培养阳性标本进行革兰染色，如涂片找到细菌，根据革兰染色结果选择药敏所有培养基（Muller-Hinton培养基或5%羊血Muller-Hinton琼脂平板），取阳性肉汤标本约0.2ml，用无菌棉签均匀涂布于琼脂表面，根据革兰染色结果选择所用抗菌药物的纸片，如镜检见革兰阴性杆菌，选用肠杆菌科常用的抗菌药物纸片；若为革兰阳性球菌，成对排列，选择葡萄球菌常用的抗菌药物纸片。

然后置于35°C，孵育6-7小时读取初步药敏结果。

次日纯培养再进行菌株鉴定和药敏试验，发出最终报告。

最终结果如与初步报告不符，应及时与临床沟通，并在书面最终报告注明变更内容。

7.1.3三级报告报告细菌种属、药敏试验、结果评价和建议。

7.2阴性结果报告血培养72小时未见细菌生长，应通知临床医师，以便作相应处理，但培养瓶要继续培养至第五日，方可发出阴性报告。

如发现有菌生长，可补发报告。

7.3对发出报告进行销号，并做好菌名或无菌及报告日期登记。

7.4传染病（伤寒沙门菌）报告医务部门和（或）防保
科。

7.5菌种保存（伤寒沙门菌），交疾控中心复核。

8.注意事项
8.1 抽血后无需更换针头即可注入血培养瓶中。

8.2 抽血前即应贴好标签，标签不能贴到条形码。

8.3 若不能立即送至实验室，应置于35°C温箱或室温，决不可放置于冰箱。

8.4 有自动血培养仪的实验室，应建立24小时值班制，可及时处理阳性报警标本。

8.5 如不同部位采集的两瓶血培养瓶出现一瓶阳性一瓶阴性，或者出现两瓶均为阳性，检测结果均为凝固酶阴性葡萄球菌，这两种情况都应该向临床报告和沟通。

9. 临床意义
引起败血症的耐药性金黄色葡萄菌、某些革兰阴性杆菌及部分球菌；疖、痈、脓肿和化脓性骨髓炎继发的败血症主要由金黄色葡萄菌和β溶血性链球菌引起；尿道、胆道、胃肠道炎症和粘膜损伤引起的败血症以大肠埃希菌最多见；烧伤后铜绿假单胞菌和金黄色葡萄菌多见。

伤寒和副伤寒于病程第1-2周做血培养，伤寒和副伤寒菌的检出率可达80%-90%。

10.危急值报告
仪器报警阳性标本直接涂片、革兰染色，确定细菌种类，。