蛋白质组学研究进展与趋势综述

蛋白质组学研究进展与趋势
蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。

1 994 年澳大利亚Macquaie 大学的Wilkins 和Williams 等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组（Proteome）这个概念。

2001 年的Science 杂志已把蛋白质组学列为六大研究热点之一，其“热度”仅次于干细胞研究，名列第二。

蛋白质组学的受关注程度如今已令人刮目相看。

本文就蛋白质组学研究相关技术与趋势等方面进行简要综述。

1．蛋白质组学研究的研究意义和背景
随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。

在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。

尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。

目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析(Serial analysisof gene expression, SAGE)等，都是从细胞中mRNA 的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA 的水平反映了蛋白质表达的水平。

但事实并不完全如此，从DNA mRNA 蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控(Transcriptional control )，翻译水平调控(Translational control)，翻译后水平调控(Posttranslationalcontrol )。

从mRNA 角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。

实验也证明，组织中mRNA 丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。

更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA 水平来判断。

毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。

蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。

虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。

传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。

这是因为：(1)生命现象的发生往往是多因素影响的，必然涉及到多个蛋白质。

(2) 多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行发生，或呈级联因果。

(3) 在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的，并不象基因组那样基本固定不变。

因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。

因此在上世纪90 年代中期，国际上产生了一门新兴学科－蛋白质组学（Proteomics），它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。

可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。

虽然第一次提出蛋白质组概念是在1994 年，但相关研究可以追溯到上世纪90 年代中期甚至更早，尤其是80 年代初，在基因组计划提出之前，就有人提出过类似的蛋白质组计划，当时称为Human Protein Index 计划，旨在分析细胞内的所有蛋白质。

但由于种种原因，这一计划被搁浅。

90 年代初期，各种技术已比较成熟，在这样的背景下，经过各国科学家的讨论，才提出蛋白质组这一
概念。

国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善。

相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也层出不穷。

1996 年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心：Australia Proteome Analysis Facility( APAF )。

丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。

在美国，各大药厂和公司在巨大财力的支持下，也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。

去年在瑞士成立的GeneProt公司，是由以蛋白质组数据库“SWISSPROT”著称的蛋白质组研究人员成立的，以应用蛋白质组技术开发新药物靶标为目的，建立了配备有上百台质谱仪的高通量技术平台。

而当年提出Human Protein Index 的美国科学家Normsn G. Anderson 也成立了类似的蛋白质组学公司，继续其多年未实现的梦想。

2001 年4 月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（Human Proteome Organization, HUPO）,随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质组计划（HumanProteome Project）。

2．蛋白质组学研究的策略和范围
蛋白质组学一经出现，就有两种研究策略。

一种可称为“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质，这种观点从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，也更符合蛋白质组学的本质。

但是，由于蛋白质表达随空间和时间不断变化，要分析生物体内所有的蛋白质是一个难以实现的目标。

另一种策略可称为“功能法”，即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。

这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。

早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式（Expression profile）, 随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。

蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。

蛋白质蛋白质相互作用的研究也已被纳入蛋白质组学的研究范畴。

而蛋白质高级结构的解析即传统的结构生物学，虽也有人试图将其纳入蛋白质组学研究范围，但目前仍独树一帜。

3．蛋白质组学研究技术
可以说，蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术限制的。

蛋白质组学研究成功与否，很大程度上取决于其技术方法水平的高低。

蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。

不仅氨基酸残基种类远多于核苷酸残基（20/ 4）, 而且蛋白质有着复杂的翻译后修
饰，如磷酸化和糖基化等，给分离和分析蛋白质带来很多困难。

此外，通过表达载体进行蛋白质的体外扩增和纯化也并非易事，从而难以制备大量的蛋白质。

蛋白质组学的兴起对技术有了新的需求和挑战。

蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理成千上万种蛋白质。

因此，发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。

当前在国际蛋白质组研究技术平台的技术基础和发展趋势有以下几个方面：
3.1 蛋白质组研究中的样品制备
通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。

也可以进行样品预分级，即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分，分别进行蛋白质组研究。

样品预分级的主要方法包括根据蛋白质溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、线粒体或高尔基体等细胞
器的蛋白质成分。

样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。

对临床组织样本进行研究，寻找疾病标记，是蛋白质组研究的重要方向之一。

但临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一。

如肿瘤组织中，发生癌变的往往是上皮类细胞，而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。

所以，常规采用的癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异比较，实际上是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较。

__而蛋白质组研究需要的通常是单一的细胞类型。

最近在组织水平上的蛋白质组样品制备方面也有新的进展，如采用激光捕获微解剖(Laser Capture Microdissection, LCM) 方法分离癌变上皮类细胞。

3.2 蛋白质组研究中的样品分离和分析
利用蛋白质的等电点和分子量通过双向凝胶电泳的方法将各种蛋白质区分
开来是一种很有效的手段。

它在蛋白质组分离技术中起到了关键作用。

如何提高双向凝胶电泳的分离容量、灵敏度和分辨率以及对蛋白质差异表达的准确检测是目前双向凝胶电泳技术发展的关键问题。

国外的主要趋势有第一维电泳采用窄
pH 梯度胶分离以及开发与双向凝胶电泳相结合的高灵敏度蛋白质染色技术，如新型的荧光染色技术。

质谱技术是目前蛋白质组研究中发展最快，也最具活力和潜力的技术。

它通过测定蛋白质的质量来判别蛋白质的种类。

当前蛋白质组研究的核心技术就是双向凝胶电泳－质谱技术，即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离，然后利用质谱对蛋白质逐一进行鉴定。

对于蛋白质鉴定而言，高通量、高灵敏度和高精度是三个关键指标。

一般的质谱技术难以将三者合一，而最近发展的质谱技术可以同时达到以上三个要求，从而实现对蛋白质准确和大规模的鉴定。

目前对蛋白质组的分析工作大两个方面。

一方面，通过二维胶电泳等技术得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱，相关数据将作为待测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。

另一方面是比较分析在变化了生理条件下蛋白质组所发生的变化。

3.3 蛋白质组研究的新技术
做过双向凝胶电泳的人一定会抱怨它的繁琐、不稳定和低灵敏度等缺点。

发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法已成为蛋白质组研究技术最主要的目标。

目前，二维色谱(2DLC)、二维毛细管电泳(2DCE)、液相色谱－毛细管电泳(LCCE)等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。

另一种策略则是以质谱技术为核心，开发质谱鸟枪法(Shotgun)、毛细管电泳质谱联用(CEMS)等新策略直接鉴定全蛋白质组混合酶解产物。

随着对大规模蛋白质相互作用研究的重视，发展高通量和高精度的蛋白质相互作用检测技术也被科学家所关注。

此外，蛋白质芯片的发展也十分迅速，并已经在临床诊断中得到应用。

3.4 蛋白质组生物信息学
蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。

瑞士的SWISSPROT拥有目前世界上最大，种类最多的蛋白质组数据库。

丹麦、英国、美国等也都建立了各具特色的蛋白质组数据库。

生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件；特别值得注意的是蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速，如SWISSPROT、Rockefeller大学、UCSF 等都有自主的搜索软件和数据管理系统。

最近发展的质谱数据直接搜寻基因组数据库使得质谱数据可直接进行基因注释、判断复杂的拼接方式。

随着基因组学的迅速推进，会给蛋白质组研究提供更多更全的数据库。

另外，对肽序列标记的从头测序软件也十分引人注目。

4．蛋白质组学的研究进展
蛋白质组学强调的是针对蛋白质的一个整体思路。

从整体的角度看，蛋白质组研究大致可分为两种类型：一种是针对细胞或组织的全部蛋白质，也就是着眼点是整个蛋白质组；而另一种是以与一个特定的生物学机制或机制相关的全部蛋白质为着眼点，在这里整体是局部性的。

针对细胞蛋白质组的完整分析的工作已经比较全面地展开，不仅如大肠杆菌、酵母等低等模式生物的蛋白质组数据库在建立之中，高等生物如水稻和小鼠等的蛋白质研究也已开展，人类一些正常和病变细胞的蛋白质数据库也已在建立之中。

与此同时，更多的蛋白质组研究工作则是将着眼点放在蛋白质组的变化或差异上，也就是通过对蛋白质组的比较分析。

首先发现并去鉴定在不同生理条件下或不同外界条件下蛋白质组中有差异的蛋白质组分。

本文不对这方面的工作做进一步论述。

本文接下来重点介绍近期发表的关于蛋白质组学的几个工作，从中可以看到蛋白质组学的思想方法在蛋白质整体（或局部整体）水平上是如何解决生理学的一些重要问题的。

1999 年11 月《Nature》杂志发表了一篇用蛋白质组学方法研究蛋白质折叠的研究论文。

在这篇文章中，Houry 等报道了在大肠杆菌胞质中的2500 种新生多肽链种只有近300 种以GroEL 作为分子伴侣来帮助其折叠成正确构象。

在以往的相关研究中，通常只是针对某个或某些特定的蛋白质，观察它（们）在折叠过程中是否需要诸如GroEL 等分子伴侣的帮助。

而在这个工作中，研究是从一个整体的思路出发，首先通过免疫共沉淀的方法获得所有与GroEL 结合的肽链，再通过二维电泳和数据库比较等蛋白质研究的手段对这些肽链进行分析鉴定，从而实现了对大肠杆菌近2500 条新生多肽链与分子伴侣GroEL 的关系的全面分析。

在这个工作中，研究者还通过对其中50 种与GroEL 作用的肽链的鉴定，进一步揭示了决定这些蛋白质能与GroEL 相互作用的关键结构特征。

应该说，这个工作很好地体现了蛋白质组学的思想方法和技术手段的运用。

过去在细胞生物学领域还没有得到过一个主要亚细胞结构的完整的分子图。

核孔复合体是一个巨大的跨核膜的八角形结构，是控制大分子在胞质和核质间运输的通道。

多年来很多方法被用来分析这一复合体的组成成分。

虽然这些工作取得了很大的进展，但究竟在多大程度上反映了这一复合体的分子原貌仍然是一个未知数。

最近通过使用蛋白质组学的手段，Rout 等鉴定了完整的酵母核孔复合体所有能检测到的多肽，并系统地对每种可能的蛋白质组分在细胞中定位，结合免疫电镜的方法将各组分在复合体内定位并定量，从而揭示了酵母核孔复合体的完整分子构造，并在此基础上揭示了其工作原理。

这个工作可以说是蛋白质组学解决构造生物学问题的一个典范，为揭示其他巨大分子机器的"构造"和工作原理指出了一条新路。

通过分析一个蛋白质是否跟功能已知的蛋白质相互作用可得到揭示其功能的线索。

因为经验告诉我们，如果两个蛋白质相互作用，那么它们一般参与相同或相关的细胞活动。

从近期国际上蛋白质组学研究的发展动向可以看出，揭示蛋白质之间的相互作用关系，建立相互作用关系的网络图，已成为揭示蛋白质组复杂体系与蛋白质功能模式的先导，业已成为蛋白质组学领域的研究热点。

2000 年初，《Science》登载了一篇应用蛋白质组学的大规模双杂交技术研究线虫生殖器发育的文章。

在这个工作中，Walhout 等以线虫的生殖发育过程作为研究对象，从已知的27 个与线虫发育的蛋白质出发，构造了一个大规模的酵母双杂交系统，得到了100 多个相互作用的结果，初步建立了与线虫生殖发育相关的蛋白质相互作用图谱，从而为深入研究和揭示线虫发育的机制等提供了丰富的线索。

这个工作不同于一般的应用酵母双杂交进行研究的地方在于，它出于对一个生物
学问题的整体思考，尽可能地从所有已知的蛋白质而不只是个别的蛋白质为出发点。

这一个工作为以前专注于信号转导过程中单个蛋白质作用的科学家们提供了一个新的思路，即将整个途径的相关蛋白质一起考虑。

那么，能否通过酵母双杂交系统来分析一种细胞或特定组织的所有可能的蛋白质之间的相互作用呢？在今年初，《Nature》发表了一篇通过大规模双杂交技术研究酵母近6000个蛋白质之间相互作用的论文。

啤酒酵母基因组DNA 的全序列业已测定，这为通过双杂交技术来鉴定酵母基因组编码的全部6000 种左右的蛋白质间的可能相互作用提供了非常有利的条件。

在这个工作中，研究人员采用了两种不同的策略对酵母的蛋白质间的相互作用作了全面分析。

一是所谓的列阵筛选法（array screening）。

在此方法中，6000 株表达不同"猎物"蛋白的酵母单克隆分别加在微滴定板上，带有不同的"诱饵"蛋白的酵母株与前面6000 株细胞一一接合形成二倍体细胞，"猎物"蛋白与"诱饵"蛋白的相互作用通过报道基因的表达而被鉴定。

这篇文章中报道了192 种不同的"诱饵"蛋白与近6000 种"猎物"蛋白的相互作用的结果。

另一种方法是文库筛选法。

该方法与前一种方法的区别是，将表达6000 种不同"猎物"蛋白的酵母细胞混在一起构成文库，再将这个文库分别与6000 株表达不同"诱饵"蛋白的酵母细胞接合，再进一步筛选鉴定阳性克隆，即"诱饵"与"猎物"发生相互作用的克隆。

根据这篇报告，上述两种策略得到了不同的结果，相比之下阵列筛选法更为有效，而文库筛选法的长处是通量大。

这一工作的重要意义在于我们已经看到，在基因组序列被了解的基础上，可以利用大规模双杂交技术全面地，当然也是初步地，分析其物种或其细胞、组织的所有蛋白质之间的相互作用关系。

相信类似的工作将很快针对其他物种开展，特别是基因组序列已被揭示的物种。

由此可见，蛋白质组学已经开始从建立数据库走向解决生命科学的重大问题，成为研究生物学问题或机制的强有力手段。

5．蛋白质组学发展趋势
在基础研究方面，近两年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，如细胞生物学、神经生物学等。

在研究对象上，覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等。

在未来的发展中，蛋白质组学的研究领域将更加广泛。

在应用研究方面，蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。

在对癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面蛋白质组技术也有十分诱人的前景，目前国际上许多大型药物公司正投入大量的人力和物力进行蛋白质组学方面的应用性研究。

因此，蛋白质组学研究不仅是探索生命奥秘的必须工作，也能为人类健康事业带来巨大的利益。

在技术发展方面，蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存，各有优势和局限的特点，而难以象基因组研究一样形成比较一致的方法。

除了发展新方法外，更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征。

另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技术新方法的活水之源，特别是，蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学等领域的交叉，所呈现出的系统生物学（System Biology）研究模式，将成为未来生命科学最令人激动的新前沿。

酶固定化技术
酶固定化技术有哪些酶固定化是指用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，进行其特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术。

根据固定酶材料与酶分子之间结合力的不同，可分为化学法和物理法。

化学法又可分为交联法和共价结合法。

交联法需要双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键，从而把酶束缚在固体材料上。

共价结合法是通过酶分子的非必须基团与载体表面的活性功能基团形成化学共价健实现不可逆结合的酶固定方法，故表现出良好的稳定性，有利于酶的连续使用，是目前应用和研究最为活跃的一类酶固定化方法，但共价偶联反应容易使酶变性而失活。

化学法所得的固定化酶与载体连接牢固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。

但该法较其它固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失更加严重。

物理法分为吸附法和包埋法。

吸附法主要通过范德化力固定酶，把酶吸附在材料表面或内表面。

根据吸附剂的特点又可分为物理吸附和离子交换吸附。

该法具有操作简便、条件温和及吸附剂可反复使用等优点，但也存在吸附力弱，易在不适pH、高盐浓度、高底物浓度及高温条件下解吸脱落的缺点。

包埋法将酶限定在载体的网格中，从而实现酶固定化，适合小分子底物的催化反应。

包埋法包括网格包埋、微囊型包埋和脂质体包埋等，包埋法中因酶本身不参与化学结合反应，故可获得较高的酶活力回收，其缺点是不适用于高分子量底物的传质和用于柱反应系统，且常有扩散限制等问题。

两种固定化方法条件温和，酶的构象变化较小或基本不变，因此对酶的催化活性影响小，但酶和载体之间结合力弱，在不适pH、高盐浓度、高温等条件下，酶易从载体脱落并污染催化反应产物等。