茶树组织培养中外植体褐化与污染问题研究

茶树组织培养中外植体褐化问题研究进展

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摘要：茶树作为重要的经济作物，其生长繁殖问题备受关注。随着植物组织培养技术的发展，茶树的繁殖育种得到了一定的发展与改善，但在茶树组织培养却也存在着组织褐化、污染等问题。由于外植体的切口，使外植体中的细胞破碎，多酚类物质外流被氧化而导致出现组织褐化。本文就目前对茶树组织培养中的外植体褐化问题研究状况做一综述，为进一步的研究提供参考。

关键词：茶树；组织培养；褐化；污染；研究进展

茶树[Camellia sinensis (L. ) O．Kuntze]属于山茶科山茶属茶组，是多年生常绿异花授粉木本植物。其叶经过加工后的饮品是世界上三大消费量最大的饮料之一，茶叶中含有对人体有益的咖啡碱、氨基酸、茶多酚等物质，具有提神醒脑、解毒利尿、“三抗三降”等功效[1]，具有营养价值和保健功效。

组织培养技术既可用于大量生产优良无性系植株，又可打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲和等障碍，对于开展茶树种质资源的保存、新品种的培育及种性改良等方面的研究具有重要意义[2]。茶树组织培养始于20世纪60年代，英国剑桥大学以茶树幼嫩茎段为离体材料研究离体咖啡碱的合成。我国茶树组织培养研究起步较晚，但近年来也取得了显著进展。通过对茶树的种子、茎段、腋芽、花药等进行培养获得了完整的再生植株[1]，但在培养过程中还存在污染、褐化等问题。

本文将重点介绍外植体褐化问题与控制方面的研究状况，旨在为研究和优化茶树组织培养技术，对茶树育种及良种繁育等方面的研究提供参考。

1外植体褐化原因

茶树外植体褐变一般是酶促褐变，茶树是多年生木本植物，其组织中酚类物质含量较高。自然界中正常生长发育的植物体内的多酚类物质主要存在于细胞液中，其底物多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)主要存在于质体细胞质内，这种天然的区域分布使得两者同时存在时不会发生氧化，而当进行组织培养时，由于外植体要进行切割造成伤口，多酚类物质与底物PPO的隔离被打破，在适合的条件下(pH、温度等)，遇到氧气就会发生氧化产生褐色物质醌类，褐色物质逐步扩散到整个培养基，最终造成外植体褐变。这些褐色的醌类物质会抑制细胞中其他酶活性，毒害整个外植体组织，外植体随之进一步褐化而导致死亡。

2影响外植体褐化的因素

2.1植物的种类与基因型

植物种类不同，其体内是否含有多酚类或多酚类的含量也不同，PPO含量也有差别，最终是否会发生褐化以及褐化的程度也会有所不同。

2.2 外植体的部位

不同年龄的植物以及同一年龄植物的不同部位，其生理状态都是不同的，所以在进行外植体培养中褐变的情况也会不同。

2.3培养基的组成成分

培养基中无机盐、激素水平、蔗糖含量等也影响着褐变的发生，培养基最终的pH值以及外植体在培养过程中所接受到的光强、温度等都对外植体的褐变有影响。有趣的是培养基中琼脂的含量也会影响到外植体的褐化程度。除此之外，取材时间、外植体的类型及消毒方式也会对褐化产生影响。

3 外植体褐化控制

3.1 消毒时间

外植体灭菌是植物组织培养的重要环节。灭菌效果的好坏严重影响组织培养的最终成活率。外植体灭菌既要少伤害外植体，又要尽可能彻底杀死组织表面的细菌、真菌。常用的外植体消毒剂有升汞、次氯酸钠、乙醇、新洁尔灭等。茶树是木本植物，在进行外植体消毒时，升汞是最佳的消毒剂，但其对材料的毒害性强于别的消毒剂，在使用时要根据外植体的类型、老嫩程度选择最佳的消毒时间。

大量实验证明，较长时间的消毒能明显降低组织培养后期污染，但却使外植体褐化程度显著增强；相反的，消毒时间短则使褐化程度降低，但污染却加重。因此通过实验探究使污染和褐化的综合影响达到最小的消毒时间是优化茶树组织培养的关键之一。黄艳芬等人的研究表明[3]，当消毒时间为6 min时，褐化率最低，仅57％，但污染率最高，达61％，污染蔓延很快，腋芽萌动生长受阻。随着消毒时间的延长，褐化率明显上升，污染率明显下降，腋芽萌动生长状况有所好转。当消毒时间为9 min时，褐化率升至91％，污染率仅为10％，外植体大部分褐化死亡。采用0.1％的升汞溶液对外植体表面消毒7—8 min，褐化率和污染率相对较低，利于腋芽萌动生长。而邬秀宏等人的研究表明[4]，在0.1％的升汞溶液灭菌时间为2 min时，污染率最高，褐化率最低；灭菌时间达到10 min时，污染率最低，而褐化率达到最高。通过灭菌时间与污染率、褐化率的线性关系可以得出，灭菌时间控制在6 min，即可使污染率和褐化率均处在较低的水平。

3.2培养基配方

就培养基组成而言，降低无机盐质量分数，可以减少酚类物质外溢，减轻外植体褐变。培养基中细胞分裂素不仅促进酚类化合物的合成还刺激多酚氧化酶的活性，增加褐变[5]。在基本培养基相同的情况下，高浓度的细胞分裂素接种外植体的褐化率明显高于低浓度的，差异达极显著水平[3]。此外，研究还表明培养基的pH和培养基的琼脂含量也会影响到茶树外植体的褐化程度。在较低的pH环境下，随着琼脂用量的降低，外植体褐化数量逐渐减少。pH值的高低决定了培养基的软硬程度和培养基渗透压，同时，pH值的高低可能对酚类物质和酚类氧化酶结合位点产生影响。在较低的pH条件下，使用较低浓度的琼脂，可适当的控制其褐化数量，外植体褐化分泌出褐色有毒物质在较软的培养基中容易扩散到培养基其他部位，因此减轻了对外植体的毒害作用。考虑到培养基凝固效果和pH值不宜过低，因此，在试验中褐化数量统计并未达到显著，当琼脂用量为5.0 g／L，pH值为5.6时，褐化率降低

为13．3％[4]。

3.3 抗褐化剂、吸附剂

Vc常作为茶树组织培养的抗褐化剂。Vc为多羟基还原物质，既可使多酚氧化酶丧失活性，阻止酚类物质的氧化，又能在酶的催化下消耗氧，使酚类物质无法氧化，从而减轻褐变的程度，利于腋芽萌动生长。实验表明，培养基中加入1．0 g／L的Vc，褐化率较对照降低12％．一定程度上减轻了外植体褐化，腋芽萌动生长势稍优于对照[3]。

而AC作为吸附剂。其主要作用在于通过氢键、范德华力等作用把有毒物质从外植体周围吸附掉，以此减轻外植体的褐变。但是AC在吸附有毒物质的同时，也会吸附培养基中的养分和生长调节剂，影响外植体的生长。

综合以上因素，在能减轻褐化的基础上，AC的加入量倾向于偏少为好；Vc、AC混合使用结果，褐化率较对照下降3l％，抗褐化能力显著提高，腋芽萌动生长势良好[3]。

此外,核黄素是一类具有抗氧化性的物质，在培养基中添加可有效抑制外植体褐化现象，当核黄素使用达到0.02和0.03 g／L时，褐化率降低为21％和20％，较对照组褐化率分别降低了35％和36％。并且在DPS数据统计中显示出与添加Vc和AC的显著性差异。其外植体萌发生长状况较对照组好，与使用0.59／L Vc生长状况相当。实验还确定了0.02 g／L 的核黄素可最为有效地防止外植体褐化现象[4]。

3.4 其他

除了上述提到的控制方法之外，有研究还发现，外植体的切割口面积大小也会影响到褐化程度。当切口不太大，培养基营养成分消耗最少，醌类物质浸染外植体和培养基的面积相对也少，腋芽萌动生长状况最好[3]。还有研究表明，勤转瓶可减轻褐化程度，提高外植体的生长质量。因为接种后转瓶间隔时间短，可减少切口周围培养基中积累的醌类物质量，减轻外植体受到的毒害[3]。

4 小结

茶树褐化现象是多种因素、多条件所控制，而且不同因素的影响效果存在着协同或拮抗作用，相当复杂。因此，在实践过程中，探索不同外植体不同的特性，在实践中不断的摸索、试验，才能找到最有效的防治褐化措施，达到最好的效果。另外，更深层次的对其分子机制水平的原理探究将会大大促进褐化控制的进展。

参考文献

[1] 吴婉婉，孙威江. 茶树组织培养研究进展[Z]. 2013: 9, 133-139.

[2] 曹丹，金孝芳. 茶树组织培养研究进展[J]. 安徽农业科学. 2014(29): 10086-10087, 10128.

[3] 黄燕芬，周国兰，赵华富. 降低茶树组织培养中外植体褐化程度的研究[J]. 西南农业学报. 2009, 22(5): 1492-1495.

[4] 邬秀宏，李中林，陈正明，等. 茶树组织培养中外植体褐化控制的研究[J]. 西南农业学报. 2012, 25(3): 1065-1068.

[5] 曹昆，李霞. 木本植物组织培养不定芽诱导研究进展[J]. 江苏林业科技. 2008, 35(5): 43-48.