丙氨酸氨基转移酶ALT活性测定
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2013/12/1
附注：
2,4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反应 并不是特异性的，α-酮戊二酸也能与 2,4-二硝基苯肼作用而显色。
2,4-二硝基苯肼本身也有类似的颜色， 因此空白管颜色较深。
2013/12/1
酶活力测定常采用测反应初速度 的方法。底物浓度的变化在起始浓度 的5％以内的速度为初速度。
2013/12/1
测定酶活力 的方法
测定完成一定量 反应所需的时间 ，即在一定条件 下将全部底物转 化为产物所需的 时间。
测定在最适宜 条件下，单位 时间内底物的 减少量或产物 的增加量。
2013/12/1
化学法
赖氏法(ReitmanFrankel法)
30 min
每100ml血清 在37℃条件下 与底物作用 60min，生成1 微克分子丙酮 酸为1单位
2013/12/1
每毫升血清在 pH=7.4，37℃ 条件下与底物作 用30min，每生 成2.5微克丙酮 酸为1单位。
单位根据比色 法所得光密度 值与分光光度 法作对比测定 求得。
操 作 步 骤
见 《实验指导》第83页
2013/12/1
实验数据及结果
管号 A520 测定管(1) 测定空白 标准管(3) 标准空白 (2) (4)
计算公式
ALT酶活性＝
(Mohun 法)
• •
A1-A2
20 × × 2.5 A3-A4
1 0.1
注意事项：
血清标本不宜溶血； 应准确保证保温条件及其他条件的一致性；
1．沉淀法 2．层析法 3．电泳法 4．结晶
2013/12/1
等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 热变性沉淀法
酶的分析
酶的活力测定
酶促反应动力学
2013/12/1
酶的活力测定
1．酶活力(Enzyme Activity)
是指酶催化化学反应的能力，也 即酶催化某一化学反应的反应速度。 2．酶反应速度
酶学分析
2013/12/1
Contents
1 2
酶的分离和纯化
酶的活力测定
酶促反应动力学 酶法分析 同工酶
3
4 5 6
2013/12/1
酶在医学上的应用
酶的分离和纯化
2013/12/1
酶的分离纯化技术路线
细胞破碎
动物、植物或微生物细胞
发酵液
酶提取 酶分离纯化
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
同位 素法
比色法
测定方法
电化 学法
荧光法
2013/12/1
比色或分光光度法
根据底物或产物在某一波长上有明显的特征吸 收差别建立起来的连续观测方法。 如NAD（P）H在340nm处有特异吸收峰，故利 用该原理可以测定以NAD(P)+或NAD(P)H为辅 酶的氧化还原酶的活力。
2013/12/1
酶的活力单位(U)及比活力
ALT活性测定的方法
Karman分光光度法
2013/12/1
比色测定法
丙氨酸 ＋ α-酮戊二酸 ALT
丙酮酸 ＋ 谷氨酸
红棕色 苯腙硝醌化合物 OH-
2,4-二硝 基苯肼
丙酮酸二硝基苯腙
2013/12/1
2013/12/1
比色测定法
金氏法(King法)
60 min
穆氏法(Mohun法)
30 min
1．酶的活力单位(U): 1个酶活力单位，是指在 特定条件下，1分钟内能将1微摩尔(μmol)底物转 化为产物所需的酶量。 2．酶的比活力 比活力的大小，就是酶含量的大小, 以U/mg 蛋白表示。
(改良Mohun法)
血清谷-丙转氨酶(ALT) 活性的测定
2013/12/1
原理
谷-丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST) 广泛分布于人体各组织器官的细胞内，且 活性很高，但正常人血清中这两种转氨酶 活性却很低，当组织受损伤，造成细胞通 透性增加乃至细胞坏死时，ALT括性和 AST活性可明显升高。因此ALT和AST活 性测定已广泛应用于临床检验。
2013ห้องสมุดไป่ตู้12/1
正常人各组织AST及ALT活性 (单位/克湿组织)
组织 心 肝 骨骼肌 肾 GOT AST 156000 142000 99000 91000 GPT ALT 7100 44000 4800 19000 组织 胰腺 脾 肺 血清 GOT AST 28000 14000 10000 20 GPT ALT 2000 1200 700 16
ALT主要分布于肝、肾细胞、心肌细胞等组织细胞内，血清中的含 量很低，当病变使细胞膜通透性增高或细胞破坏时，则血清ALT含量明 显升高。该项检验可作为疾病诊断和预后判断的指标之一。 肝细胞中含ALT最丰富, 测定ALT酶活性是检查肝功能的重要指标之 一.ALT显著增高见于各种急性期肝炎及药物中毒性肝细胞坏死，中等程 度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高见于阻塞性 黄疸及胆道炎等疾病。
酶的分离和纯化
1．材料的选取与预处理
一般常选择来源丰富、有效成分含量丰 富的脏器组织或细胞为原材料 动物组织常需绞碎 、脱脂等预处理以便 于有效成分的提取
2013/12/1
酶的分离和纯化
2．细胞的破碎
尽可能采用研磨超声破碎等物理方法；
缓冲液抽提 低温(O～4℃)操作
2013/12/1
酶的纯化
盐析法 聚乙二醇沉淀法
附注：
2,4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反应 并不是特异性的，α-酮戊二酸也能与 2,4-二硝基苯肼作用而显色。
2,4-二硝基苯肼本身也有类似的颜色， 因此空白管颜色较深。
2013/12/1
酶活力测定常采用测反应初速度 的方法。底物浓度的变化在起始浓度 的5％以内的速度为初速度。
2013/12/1
测定酶活力 的方法
测定完成一定量 反应所需的时间 ，即在一定条件 下将全部底物转 化为产物所需的 时间。
测定在最适宜 条件下，单位 时间内底物的 减少量或产物 的增加量。
2013/12/1
化学法
赖氏法(ReitmanFrankel法)
30 min
每100ml血清 在37℃条件下 与底物作用 60min，生成1 微克分子丙酮 酸为1单位
2013/12/1
每毫升血清在 pH=7.4，37℃ 条件下与底物作 用30min，每生 成2.5微克丙酮 酸为1单位。
单位根据比色 法所得光密度 值与分光光度 法作对比测定 求得。
操 作 步 骤
见 《实验指导》第83页
2013/12/1
实验数据及结果
管号 A520 测定管(1) 测定空白 标准管(3) 标准空白 (2) (4)
计算公式
ALT酶活性＝
(Mohun 法)
• •
A1-A2
20 × × 2.5 A3-A4
1 0.1
注意事项：
血清标本不宜溶血； 应准确保证保温条件及其他条件的一致性；
1．沉淀法 2．层析法 3．电泳法 4．结晶
2013/12/1
等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 热变性沉淀法
酶的分析
酶的活力测定
酶促反应动力学
2013/12/1
酶的活力测定
1．酶活力(Enzyme Activity)
是指酶催化化学反应的能力，也 即酶催化某一化学反应的反应速度。 2．酶反应速度
酶学分析
2013/12/1
Contents
1 2
酶的分离和纯化
酶的活力测定
酶促反应动力学 酶法分析 同工酶
3
4 5 6
2013/12/1
酶在医学上的应用
酶的分离和纯化
2013/12/1
酶的分离纯化技术路线
细胞破碎
动物、植物或微生物细胞
发酵液
酶提取 酶分离纯化
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
同位 素法
比色法
测定方法
电化 学法
荧光法
2013/12/1
比色或分光光度法
根据底物或产物在某一波长上有明显的特征吸 收差别建立起来的连续观测方法。 如NAD（P）H在340nm处有特异吸收峰，故利 用该原理可以测定以NAD(P)+或NAD(P)H为辅 酶的氧化还原酶的活力。
2013/12/1
酶的活力单位(U)及比活力
ALT活性测定的方法
Karman分光光度法
2013/12/1
比色测定法
丙氨酸 ＋ α-酮戊二酸 ALT
丙酮酸 ＋ 谷氨酸
红棕色 苯腙硝醌化合物 OH-
2,4-二硝 基苯肼
丙酮酸二硝基苯腙
2013/12/1
2013/12/1
比色测定法
金氏法(King法)
60 min
穆氏法(Mohun法)
30 min
1．酶的活力单位(U): 1个酶活力单位，是指在 特定条件下，1分钟内能将1微摩尔(μmol)底物转 化为产物所需的酶量。 2．酶的比活力 比活力的大小，就是酶含量的大小, 以U/mg 蛋白表示。
(改良Mohun法)
血清谷-丙转氨酶(ALT) 活性的测定
2013/12/1
原理
谷-丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST) 广泛分布于人体各组织器官的细胞内，且 活性很高，但正常人血清中这两种转氨酶 活性却很低，当组织受损伤，造成细胞通 透性增加乃至细胞坏死时，ALT括性和 AST活性可明显升高。因此ALT和AST活 性测定已广泛应用于临床检验。
2013ห้องสมุดไป่ตู้12/1
正常人各组织AST及ALT活性 (单位/克湿组织)
组织 心 肝 骨骼肌 肾 GOT AST 156000 142000 99000 91000 GPT ALT 7100 44000 4800 19000 组织 胰腺 脾 肺 血清 GOT AST 28000 14000 10000 20 GPT ALT 2000 1200 700 16
ALT主要分布于肝、肾细胞、心肌细胞等组织细胞内，血清中的含 量很低，当病变使细胞膜通透性增高或细胞破坏时，则血清ALT含量明 显升高。该项检验可作为疾病诊断和预后判断的指标之一。 肝细胞中含ALT最丰富, 测定ALT酶活性是检查肝功能的重要指标之 一.ALT显著增高见于各种急性期肝炎及药物中毒性肝细胞坏死，中等程 度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高见于阻塞性 黄疸及胆道炎等疾病。
酶的分离和纯化
1．材料的选取与预处理
一般常选择来源丰富、有效成分含量丰 富的脏器组织或细胞为原材料 动物组织常需绞碎 、脱脂等预处理以便 于有效成分的提取
2013/12/1
酶的分离和纯化
2．细胞的破碎
尽可能采用研磨超声破碎等物理方法；
缓冲液抽提 低温(O～4℃)操作
2013/12/1
酶的纯化
盐析法 聚乙二醇沉淀法