酪氨酸酶抑制剂筛选

实验原理
酪氨酸酶催化的反应为：
475nm
酶活的定义
1.酪氨酸酶的酶活定义: 以每分钟催化生成1umol多 巴色素的酶量为一个活力单位。 通过测定酶催化反 应体系OD475随时间的增长曲线, 从曲线斜率即可得 到酶活=106kv/ε (k斜率 v体积l ε消光系数) 酶比活=106 kv/εm(k斜率,v体积L,ε消光系数,m酶质量 mg ) 2.剩余酶活％=Kt/K ×100 ％ 3.抑制酶活％ （被抑制的活力）=（K-Kt)/K ×100 ％ Kt=有抑制剂的曲线的斜率 K=没有抑制剂的曲线的斜率
延滞时间的原理（多巴为例）
对酪氨酸酶单酚酶（二酚酶）影响
抑制剂浓度—延滞时间 作图 抑制剂浓度—Vss 作图
IC50
Vss为酶的活力百分比=Vt/V ×100 ％ IC50即为酶失去一半活力时的抑制剂
结论
• • • • • 上述三个图标我们可以得出几点结论 1.抑制剂浓度对酶的延滞时间是否有影响？ 2.计算出酶的活力（酶的剩余活力） 3.计算酶的抑制酶活 4.酶的IC50
曲线1-5抑制剂浓度逐渐上
升（曲线1为对照品） 曲线相交一点且在X轴上 Km值不变，Vm值随浓度 上升而变小
非竞争性图
1.以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的斜率作图，该图的斜率即 为Ki 2.以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的截距作图，该图的斜率即 为Kis 3.非竞争抑制中Ki，Kis的值是一致的
3.反竞争性
Substrate/Product Inhibitors KM Value Ki Value IC50 Value pH Optimum
酪氨酸酶概述
• 酪氨酸酶（TYR）含铜酶是黑素代谢和儿茶酚胺的 关键酶。酪氨酸酶活性高，黑色素生成增多。因 此，抑制酪氨酸酶活性是有效减少黑色素生成的 一种途径
• 研究酪氨酸酶抑制剂主要运用于美容行业，防止 植物水果的褐变症。 • 酪氨酸酶结构中心的两个Cu+是活性中心
抑制剂种类
1.含酚基的化合物 与酪氨酸酶的双铜离子活性中心结合, 大多数是酪氨酸酶的竞争性抑 制剂. 2.芪类及其类似物 只有一个羟基取代基时, 该羟基芪没有抑制酪氨酸酶的活性; 当结构 中有两个羟基时, 对酪氨酸酶的抑制活性显著增强 3.黄酮类物质 螯合酶活性中心的铜来抑制酶活力. 4. 醛类化合物 羰基与酪氨酸酶活性中心周围的亲核基团， 形成稳定的螯合配体结构 (席夫碱结构), 生成的产物在酪氨酸酶的疏水性环境中能稳定存在, 并在活 性中心周围形成空间位阻, 阻止底物与活性中心作用, 从而抑制酪氨酸酶 的催化活性, 抑制黑色素的合成.
抑制类型的判断
• • • • 可逆型抑制类型分为 1.竞争性抑制 2.非竞争性抑制 3.反竞争性抑制
三种类型图示
使1/ v（酶速度）对1/S（酶浓度）作图，可 以获得一条直线。
抑制常数： 1.Km为米氏常数 2.Ki为与酶结合的抑制常数 3.Kis为与酶底物复合物的抑制常数
Km值测定: 米氏双倒数作图法
• 对酶活性的一种抑制作用，其特征是反应 的最大速度比未加抑制剂时反应的最大速 度低，当以速度的倒数相对底物浓度的倒 数作图，所得图线与未被抑制反应的图线 平行 • 抑制剂只与酶-底物复合物结合，而不与游 离酶结合的一种酶促反应抑制作用。
反竞争性图
抑制剂只与酶底物复合物结合 Kis 反竞争： 两线K相差0.01 截距相差0.1 Km值变小，Vmax值变小，但 Vmax/Km值不变 以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的截 距作图，该图的斜率即为Kis
特殊抑制类型
混合型的抑制：曲线相交与一点但该点不在X或Y轴上， 一般在第二或三象限
混合型 抑制剂既于酶又与底物结合 Ki Kis
特殊抑制类型
混合型的Ki Kis值与非竞争性计算方式一样 切记：两个数值不一样
总结性图表
抑制剂对单酚酶，多酚酶作用图示
谢谢
米氏方程
Vmax [S] v K m [S]
非竞争性
1. 非竞争性抑制作用：抑制剂不能与游离酶 结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生成， 使酶的催化活性降低 2. 特点为：a.抑制剂与底物可同时与酶的不同 部位结合；b.必须有底物存在，抑制剂才能对 酶产生抑制作用；c.动力学参数
非竞争性
抑制剂既于酶又与底物结合 Ki Kis
非竞争： 两线K相交于（-1/Km，0）
酶在不同浓度抑制剂下的作用
该次的测量主要断定此抑制是否可逆？ 酶浓度 抑制剂浓度 OD值 A E 对照 AE AF AG AH B F BE BF BG BH C G CE CF CG CH D H DE DF DG DH
酶在不同浓度抑制剂下的作用
• 以酶浓度—OD值作图 转换
酶浓度—酶活力（剩余活力）
缓冲液（不含抑制剂）
记录每分钟
含底物缓冲液+
不同浓度的抑制剂
+ 酶液
的OD值
30度水浴10min
对酪氨酸酶单酚酶（二酚酶）影响
以OD值—时间作图
曲线的切线反向延长与X轴相交点 即为—延滞时间 若均相交于一点—抑制剂对延滞 时间没有影响 若不交于一点—抑制剂对延滞时 间有影响 曲线1为无抑制剂的对照组 曲线2—7抑制剂浓度由低到高 切线斜率即为酶活
可逆性抑制作用
1.曲线1-5代表不同浓度（有低到高） 的抑制剂，曲线1不加抑制剂的对照组 Y轴是酶活活力,是剩余酶活。所以酶活 达不到100 2.该图是可逆型的，酶活随抑制剂浓度 上升而下降 3.Vm值不变 Km值随浓度上升而上升
上图即为可逆型抑制
不可逆性抑制作用
Km值不变， Vm值与抑制剂量成反比，增大抑制剂量可使反 应速度变为0
竞争性图
抑制剂只与酶结合 Ki 竞争： 两线K相交于（0 ，1/Vm） 曲线相交一点且在Y轴上 Vm值不变，Km值随浓度 上升而变大 以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的截 距作图，该图的斜率即为Ki
2.非竞争性
• 非竞争性抑制剂和底物可能分别与酶的不 同部位结合。抑制剂与酶的结合并不妨碍 酶再与底物结合，但所形成的酶—底物—抑 制剂复合
1.竞争性抑制
• 抑制剂和底物在结构上有某些相似之处， 二者可能竞争与酶分子的同一部位结合。
竞争性抑制
一.特点：抑制剂与底物竞争酶的活性部位， 当抑制剂与酶的活性部位结合后，底物就不 能再与酶结合，同样反之。 二.竞争性抑制的机理 1 抑制剂与底物在结构上有类似之处 2 可能结合在底物所结合的位点（如结合基 团）上，从而阻断了底物和酶的结合 3 降低酶和底物的亲和力。
酪氨酸酶抑制性实验
酪氨酸酶
底物
酪氨酸酶
产物（++++++）多
底物
抑制剂
产物 （++）少或无
EC是各种酶的编号 可在The Comprehensive Enzyme Information System（BRENDA）数据库 中找到对应的酶信息
Enzyme-Ligand Interactions
酶信息
零级反应
混合级反应
½ Vmax
一级反应
Km
一级反应中可求反应初速度
一、酶活力测定— 酶反应初速度的测定:
常用单位时间内、产物的浓度增加量表示。
Product Concentration
A =εC d
: 3600 M-1cm-1 d: 1cm
确定Leabharlann Baidu反 应时间！
Time
v= dC /dt
返回
酶活的推导
1.Beer定律A=kbc，公式A=kbc kbc εc 我们测得的动力学曲线斜率△A/t= ε△c/t= ε△M/tV △M/t=△A V /tε △M/t = kv/ε
△M/t：每分钟多巴色素的生成（mol/min），等同 于每分钟的分解量
酶活测量步骤
1.抑制剂对酪氨酸酶单酚酶（二酚酶）影响