肿瘤靶向高分子碲化镉量子点复合纳米粒的制备及其表征

药学学报Acta Pharmaceutica Sinica2014,49(10):1457−1465・1457・肿瘤靶向高分子碲化镉量子点复合纳米粒的制备及其表征

朱红艳,朱景平,谢爱梅,袁静,花烨,张伟*

(南通大学药学院,江苏南通226001)

摘要:本文采用水热法合成N-乙酰-L-半胱氨酸稳定的碲化镉量子点(CdTe quantum dots,CdTe QDs),采用配体置换的方法制备得到氨基脱氧葡萄糖(2-amino-2-deoxy-D-glucose,DG)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)与9聚精氨酸(9-D-arginine,9R)共同修饰的碲化镉量子点(9R/DG-CdTe QDs)。通过紫外、荧光光谱、傅里叶红外光谱、核磁共振氢谱、高效液相−质谱联用、聚丙烯酰胺凝胶电泳和透射电子显微镜等手段对该复合量子点进行表征,并对该复合纳米粒的生物相容性、肿瘤靶向性及穿细胞膜的效果进行考察。结果表明,通过配体置换的方法可以成功构建DG、9R、PEG修饰的CdTe QDs复合纳米粒。TEM结果显示,该纳米粒分散性较好,粒径约为8～10nm。化学修饰后的CdTe QDs吸收峰从480nm红移至510nm,发射峰从627nm红移至659nm。通过DG、9R、PEG的修饰还能进一步改善量子点的生物相容性,提高对葡萄糖转运体1高表达的肿瘤细胞的靶向性,增加量子点穿过细胞膜进入细胞浆的作用。

关键词:量子点;氨基葡萄糖;聚乙二醇;精氨酸;肿瘤

中图分类号:R943文献标识码:A文章编号:0513-4870(2014)10-1457-09

Preparation and characterization of tumor targeted CdTe quantum

dots modified with functional polymer

ZHU Hong-yan,ZHU Jing-ping,XIE Ai-mei,YUAN Jing,HUA Ye,ZHANG Wei*

(School of Pharmacy,Nantong University,Nantong226001,China)

Abstract:N-acetyl-L-cysteine(NAC)capped quantum dots(QDs)were synthesized by a hydrothermal method and coated with2-amino-2-deoxy-D-glucose(DG),polyethylene glycol(PEG),and9-D-arginine(9R).The optical properties,morphology and structure of9R/DG-coated CdTe QDs were characterized by ultraviolet-visible spectrometry,fluorescence spectrum,fourier transform infrared(FTIR),proton nuclear magnetic resonance (1H NMR),liquid chromatography-mass spectrometer(LC-MS),sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)and transmission electron micrographs(TEM).Furthermore,the biocompatibility, tumor targeted ability and transmembrane action of9R/DG-coated CdTe QDs were studied.Results indicated that9R/DG-coated CdTe QDs was constructed successfully by ligand exchange.The9R/DG-coated CdTe QDs with the size of8−10nm had good dispersity and the absorbance and fluorescence peaks of CdTe QDs after modification were red shifted from480nm to510nm and627nm to659nm,respectively.In addition,the CdTe QDs modified by PEG,DG and9R displayed good biocompatibility,high targeted ability to the cancer cells with glucose transporter type1(GLUT1)receptor high expression and obvious transmembrane ability.

Key words:quantum dot;glucosamine;polyethylene glycol;arginine;neoplasm

收稿日期:2014-04-10;修回日期:2014-07-15.

基金项目:国家自然科学青年基金项目(81202467);江苏省青年科学基金项目(BK2012232);江苏省教育厅高校自然科学研究面上项目(11KJB350004);江苏省高校优势学科建设工程资助项目.

*通讯作者Tel/Fax:86-513-85051728,E-mail:zhangwntu@

・1458・药学学报Acta Pharmaceutica Sinica2014,49(10):1457−1465

量子点(quantum dots,QDs)是近年来发展的一类新型的无机纳米荧光探针,由II-VI或III-V族元素组成,其粒径约为1～50nm,具有激发光谱宽,发射波长可“调谐”且对称,光稳定性高,荧光寿命长等优点。这些优势使量子点在生命科学领域,尤其在体内成像[1,2]、药物传输[3−5]、生物标记[6−9]、以及纳米医学[10−14]等方面显示出巨大的应用价值。尽管量子点在荧光探针和细胞标记成像领域已有报道,但应用并不广泛,主要原因在于量子点在合成和应用中存在的一些急需改进的问题。目前,有机相合成法是比较成熟完善的量子点制备方法,但用此法合成的量子点表面含有大量的氧化三辛基膦和三辛基膦等有机配体,用于荧光探针和细胞成像时,需要通过包壳或配体交换方式进行转相,过程操作烦琐费时,还容易导致量子点荧光性能的减弱,限制了量子点的使用。而水相法合成量子点虽然适用于生物学研究,但水溶性量子点常用的配体如巯基乙酸、巯基丙酸和巯基乙胺等,毒性都很大,因此也不太适合直接应用于生物医学领域[15,16]。

QDs与生物相容性好的高分子材料的连接是QDs应用于生物医学领域的一个关键步骤,由于生物材料的特殊结构和自组装功能已被用于辅助合成复杂的纳米材料,利用高分子材料的特殊结构和性质修饰量子点拓宽了量子点在生物领域的应用,制备得到的量子点具有很好的生物兼容性,可直接用于生物体系的分析测试[17−20],而表面修饰的量子点探针在生物成像领域更显示出较大的优越性。

本文采用水热法合成N-乙酰-L-半胱氨酸稳定的碲化镉量子点(CdTe quantum dots,CdTe QDs),进一步与生物高分子材料通过配体交换制备,其中生物高分子材料主要由聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)与穿膜肽9聚精氨酸(9-poly-D-arginine,9R)通过L-赖氨酸连接,并对PEG的一端进行D-氨基葡萄糖(2-amino-2-deoxy-D-glucose,DG)靶向修饰,得到的高分子材料表面修饰的CdTe QDs复合物可望用于肿瘤的靶向诊断。

材料与方法

药品与试剂氯化镉(CdCl2,99.0%)、碲粉(Te, 99.99%)、硼氢化钠(NaBH4,98.0%)、α-硫辛酸(lipoic acid,LA,99.0%)等购于中国医药集团上海化学试剂公司。N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acety-L-cysteine,NAC, 99.0%)、二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide, DCC,99.0%)、N-羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxy-succi namide,NHS,99.0%)、Boc-L-赖氨酸(Boc-L-lysine,Boc-Lys-OH,98.0%)、D-氨基葡萄糖(DG,98.0%)等购于阿拉丁试剂(上海)有限公司。聚乙二醇(PEG,98.6%)购于上海怡炎生物科技有限公司、9-聚精氨酸(9R,98.0%)购于吉尔生化(上海)有限公司。其余试剂均为市售分析纯或化学纯。细胞培养所用的RPMI1640培养基、新生小牛血清、胰酶、溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑购于上海碧云天生物技术有限公司。实验所用人肿瘤细胞株均购于中国科学院生化细胞研究所。

仪器754PC紫外可见分光度计(上海菁华科技仪器有限公司);RF-5301PC荧光分光光度计(日本岛津公司);Tecnai G2F20S-TWIN透射电镜(飞利浦公司);傅立叶变换红外光谱仪Nicolet ECO2000 (赛默飞世尔科技);核磁共振仪Bruker AV-500NMR Spectrometer(布鲁克仪器有限公司);BX60荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯株式会社)。

CdTe量子点的制备分别称取碲粉50mg和硼氢化钠80mg(碲粉和硼氢化钠摩尔比为1∶5)溶于3.5mL乙醇中,通入氮气保护。然后,向溶液中加入去离子水1.5mL,在60℃搅拌下反应30min;向上述溶液中加入0.5mol·L−1硫酸5.5mL,产生碲化氢气体。将碲化氢用0.2mol·L−1NaOH溶液0.75mL吸收,制成特定浓度的NaHTe溶液。

称取NAC147mg溶于33mL去离子水,用0.2mol·L−1NaOH调节溶液pH至8～9,再加入0.1 mol·L−1氯化镉溶液3mL搅拌。在氮气保护下,将新制成的NaHTe溶液加入到已制备好的镉溶液中,反应40min,形成CdTe前体,100℃回流,得到NAC 稳定的CdTe量子点。

量子点表面配体的制备

硫辛酸−赖氨酸复合物(LA-Lys)的制备将硫辛酸(LA)100mg溶于5mL富马酸二甲脂(DMF)溶液中,加入二环己基碳二亚胺(DCC),搅拌15min后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(硫辛酸∶DCC∶NHS 的摩尔比为1∶1.2∶1.5),室温搅拌过夜,除去副产物得到硫辛酸活化酯,再加入Boc-L-赖氨酸(Boc-Lys-OH)140mg室温搅拌过夜,即得硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的连接产物。之后将硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的连接产物溶于二氯甲烷/三氟乙酸体积比为7∶3的体系,室温搅拌过夜,脱去L-赖氨酸氨基上的Boc 保护,制备得到LA-Lys复合物。

硫辛酸−赖氨酸-9R(LA-Lys-9R)的制备将氨基端Fmoc保护的9R1mg溶于5mL DMF溶液中,