肿瘤靶向高分子碲化镉量子点复合纳米粒的制备及其表征

药学学报Acta Pharmaceutica Sinica2014,49(10):1457?1465?1457?肿瘤靶向高分子碲化镉量子点复合纳米粒的制备及其表征

朱红艳,朱景平,谢爱梅,袁静,花烨,张伟*

(南通大学药学院,江苏南通226001)

摘要:本文采用水热法合成N-乙酰-L-半胱氨酸稳定的碲化镉量子点(CdTe quantum dots,CdTe QDs),采用配体置换的方法制备得到氨基脱氧葡萄糖(2-amino-2-deoxy-D-glucose,DG)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)与9聚精氨酸(9-D-arginine,9R)共同修饰的碲化镉量子点(9R/DG-CdTe QDs)。通过紫外、荧光光谱、傅里叶红外光谱、核磁共振氢谱、高效液相?质谱联用、聚丙烯酰胺凝胶电泳和透射电子显微镜等手段对该复合量子点进行表征,并对该复合纳米粒的生物相容性、肿瘤靶向性及穿细胞膜的效果进行考察。结果表明,通过配体置换的方法可以成功构建DG、9R、PEG修饰的CdTe QDs复合纳米粒。TEM结果显示,该纳米粒分散性较好,粒径约为8～10nm。化学修饰后的CdTe QDs吸收峰从480nm红移至510nm,发射峰从627nm红移至659nm。通过DG、9R、PEG的修饰还能进一步改善量子点的生物相容性,提高对葡萄糖转运体1高表达的肿瘤细胞的靶向性,增加量子点穿过细胞膜进入细胞浆的作用。

关键词:量子点;氨基葡萄糖;聚乙二醇;精氨酸;肿瘤

中图分类号:R943文献标识码:A文章编号:0513-4870(2014)10-1457-09

Preparation and characterization of tumor targeted CdTe quantum

dots modified with functional polymer

ZHU Hong-yan,ZHU Jing-ping,XIE Ai-mei,YUAN Jing,HUA Ye,ZHANG Wei*

(School of Pharmacy,Nantong University,Nantong226001,China)

Abstract:N-acetyl-L-cysteine(NAC)capped quantum dots(QDs)were synthesized by a hydrothermal method and coated with2-amino-2-deoxy-D-glucose(DG),polyethylene glycol(PEG),and9-D-arginine(9R).The optical properties,morphology and structure of9R/DG-coated CdTe QDs were characterized by ultraviolet-visible spectrometry,fluorescence spectrum,fourier transform infrared(FTIR),proton nuclear magnetic resonance (1H NMR),liquid chromatography-mass spectrometer(LC-MS),sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)and transmission electron micrographs(TEM).Furthermore,the biocompatibility, tumor targeted ability and transmembrane action of9R/DG-coated CdTe QDs were studied.Results indicated that9R/DG-coated CdTe QDs was constructed successfully by ligand exchange.The9R/DG-coated CdTe QDs with the size of8?10nm had good dispersity and the absorbance and fluorescence peaks of CdTe QDs after modification were red shifted from480nm to510nm and627nm to659nm,respectively.In addition,the CdTe QDs modified by PEG,DG and9R displayed good biocompatibility,high targeted ability to the cancer cells with glucose transporter type1(GLUT1)receptor high expression and obvious transmembrane ability.

Key words:quantum dot;glucosamine;polyethylene glycol;arginine;neoplasm

收稿日期:2014-04-10;修回日期:2014-07-15.

基金项目:国家自然科学青年基金项目(81202467);江苏省青年科学基金项目(BK2012232);江苏省教育厅高校自然科学研究面上项目(11KJB350004);江苏省高校优势学科建设工程资助项目.

*通讯作者Tel/Fax:86-513-85051728,E-mail:zhangwntu@

?1458?药学学报Acta Pharmaceutica Sinica2014,49(10):1457?1465

量子点(quantum dots,QDs)是近年来发展的一类新型的无机纳米荧光探针,由II-VI或III-V族元素组成,其粒径约为1～50nm,具有激发光谱宽,发射波长可“调谐”且对称,光稳定性高,荧光寿命长等优点。这些优势使量子点在生命科学领域,尤其在体内成像[1,2]、药物传输[3?5]、生物标记[6?9]、以及纳米医学[10?14]等方面显示出巨大的应用价值。尽管量子点在荧光探针和细胞标记成像领域已有报道,但应用并不广泛,主要原因在于量子点在合成和应用中存在的一些急需改进的问题。目前,有机相合成法是比较成熟完善的量子点制备方法,但用此法合成的量子点表面含有大量的氧化三辛基膦和三辛基膦等有机配体,用于荧光探针和细胞成像时,需要通过包壳或配体交换方式进行转相,过程操作烦琐费时,还容易导致量子点荧光性能的减弱,限制了量子点的使用。而水相法合成量子点虽然适用于生物学研究,但水溶性量子点常用的配体如巯基乙酸、巯基丙酸和巯基乙胺等,毒性都很大,因此也不太适合直接应用于生物医学领域[15,16]。

QDs与生物相容性好的高分子材料的连接是QDs应用于生物医学领域的一个关键步骤,由于生物材料的特殊结构和自组装功能已被用于辅助合成复杂的纳米材料,利用高分子材料的特殊结构和性质修饰量子点拓宽了量子点在生物领域的应用,制备得到的量子点具有很好的生物兼容性,可直接用于生物体系的分析测试[17?20],而表面修饰的量子点探针在生物成像领域更显示出较大的优越性。

本文采用水热法合成N-乙酰-L-半胱氨酸稳定的碲化镉量子点(CdTe quantum dots,CdTe QDs),进一步与生物高分子材料通过配体交换制备,其中生物高分子材料主要由聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)与穿膜肽9聚精氨酸(9-poly-D-arginine,9R)通过L-赖氨酸连接,并对PEG的一端进行D-氨基葡萄糖(2-amino-2-deoxy-D-glucose,DG)靶向修饰,得到的高分子材料表面修饰的CdTe QDs复合物可望用于肿瘤的靶向诊断。

材料与方法

药品与试剂氯化镉(CdCl2,99.0%)、碲粉(Te, 99.99%)、硼氢化钠(NaBH4,98.0%)、α-硫辛酸(lipoic acid,LA,99.0%)等购于中国医药集团上海化学试剂公司。N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acety-L-cysteine,NAC, 99.0%)、二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide, DCC,99.0%)、N-羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxy-succi namide,NHS,99.0%)、Boc-L-赖氨酸(Boc-L-lysine,Boc-Lys-OH,98.0%)、D-氨基葡萄糖(DG,98.0%)等购于阿拉丁试剂(上海)有限公司。聚乙二醇(PEG,98.6%)购于上海怡炎生物科技有限公司、9-聚精氨酸(9R,98.0%)购于吉尔生化(上海)有限公司。其余试剂均为市售分析纯或化学纯。细胞培养所用的RPMI1640培养基、新生小牛血清、胰酶、溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑购于上海碧云天生物技术有限公司。实验所用人肿瘤细胞株均购于中国科学院生化细胞研究所。

仪器754PC紫外可见分光度计(上海菁华科技仪器有限公司);RF-5301PC荧光分光光度计(日本岛津公司);Tecnai G2F20S-TWIN透射电镜(飞利浦公司);傅立叶变换红外光谱仪Nicolet ECO2000 (赛默飞世尔科技);核磁共振仪Bruker AV-500NMR Spectrometer(布鲁克仪器有限公司);BX60荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯株式会社)。

CdTe量子点的制备分别称取碲粉50mg和硼氢化钠80mg(碲粉和硼氢化钠摩尔比为1∶5)溶于3.5mL乙醇中,通入氮气保护。然后,向溶液中加入去离子水1.5mL,在60℃搅拌下反应30min;向上述溶液中加入0.5mol·L?1硫酸5.5mL,产生碲化氢气体。将碲化氢用0.2mol·L?1NaOH溶液0.75mL吸收,制成特定浓度的NaHTe溶液。

称取NAC147mg溶于33mL去离子水,用0.2mol·L?1NaOH调节溶液pH至8～9,再加入0.1 mol·L?1氯化镉溶液3mL搅拌。在氮气保护下,将新制成的NaHTe溶液加入到已制备好的镉溶液中,反应40min,形成CdTe前体,100℃回流,得到NAC 稳定的CdTe量子点。

量子点表面配体的制备

硫辛酸?赖氨酸复合物(LA-Lys)的制备将硫辛酸(LA)100mg溶于5mL富马酸二甲脂(DMF)溶液中,加入二环己基碳二亚胺(DCC),搅拌15min后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(硫辛酸∶DCC∶NHS 的摩尔比为1∶1.2∶1.5),室温搅拌过夜,除去副产物得到硫辛酸活化酯,再加入Boc-L-赖氨酸(Boc-Lys-OH)140mg室温搅拌过夜,即得硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的连接产物。之后将硫辛酸与Boc-L-赖氨酸的连接产物溶于二氯甲烷/三氟乙酸体积比为7∶3的体系,室温搅拌过夜,脱去L-赖氨酸氨基上的Boc 保护,制备得到LA-Lys复合物。

硫辛酸?赖氨酸-9R(LA-Lys-9R)的制备将氨基端Fmoc保护的9R1mg溶于5mL DMF溶液中,

朱红艳等:肿瘤靶向高分子碲化镉量子点复合纳米粒的制备及其表征

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搅拌5min 后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)、NHS (9R ∶EDC ∶NHS =1∶1.2∶1.5),常温搅拌4h,活化9R 一端的羧基,再加入脱掉Boc 的硫辛酸?赖氨酸(9R 与硫辛酸?赖氨酸的摩尔比为1∶1.5),常温搅拌4h,与脱Boc 保护后的硫辛酸?赖氨酸的氨基连接,最后经透析处理后备用。LA-Lys-9R 的合成路线见图1

。

Figure 1Synthetic scheme of compound of lipoic acid,lysine,and 9-poly-D -arginine (LA-Lys-9R)

D -氨基葡萄糖与聚乙二醇复合物(DG-PEG)的制备

将氨基端Boc 保护的NH 2-PEG-COOH 100mg

溶于5mL DMF 溶液中,加入DCC 、NHS (PEG ∶DCC ∶NHS =1∶1.2∶1.5),室温条件下搅拌过夜,去除副产物,得到羧基端活化的PEG 。D -氨基葡萄糖(DG)15mg 溶于2mL DMF 溶液中,搅拌5min 后加入三乙胺40mg,搅拌15min 后滴加到羧基端活化的PEG 溶液中,常温反应4h,形成DG-PEG 复合物。

DG-PEG 与硫辛酸?赖氨酸-9R 复合物(DG-PEG-LA-Lys-9R)的合成

将DG-PEG 174mg 溶于5mL

二氯甲烷?三氟乙酸7∶3的体系,室温搅拌过夜,脱去PEG 氨基端上的Boc 保护。然后,将硫辛酸?赖氨酸-9R 100mg 溶于5mL DMF 溶液中,搅拌5min 后加入EDC 、NHS (硫辛酸?赖氨酸-9R ∶EDC ∶NHS =1∶1.2∶1.5),常温搅拌4h,将硫辛酸?赖氨酸-9R 中赖氨

酸上的羧基活化,再加入DG-PEG 的DMF 溶液,常温搅拌4h,与DG-PEG 的氨基端反应(硫辛酸?赖氨酸-9R 与DG-PEG 的摩尔比为1∶1)。最后将上述合成产物溶于DMF 中,搅拌5min 后加入20%哌啶,DMF 与哌啶体积比为5∶1,室温反应30min,脱去9R 上氨基保护的Fmoc 。DG-PEG-LA-Lys-9R 的合成路线见图2

。

Figure 2Synthetic scheme of compound of 2-amino-2-deoxy-D -glucose,polyethylene glycol,lipoic acid,lysine,and 9-poly-D -arginine (DG-PEG-LA-Lys-9R)

通过配体置换制备量子点复合纳米粒将上述

制备得到的配体0.05mmol 溶于无水乙醇/水体积比1∶1的体系中,加入0.75mmol 硼氢化钠还原配体中硫辛酸上的二硫键,4h 后将0.04mmol CdTe 量子点滴加到所合成配体的乙醇/水溶液中,60℃恒温水浴中避光搅拌12h,通过配体置换即得以DG-PEG 与硫辛酸?赖氨酸-9R 复合物为配体的量子点复合纳米粒(9R/DG-coated CdTe QDs)。见图3。

量子点复合纳米粒的性质表征先将制得的表面配体冻干粉末采用KBr 制片,然后采用傅里叶红外光谱(fourier transform infrared,FTIR)分析。使用核磁共振仪测定表面配体的核磁波谱(proton nuclear magnetic resonance,1H NMR)。质谱分析采用高效液相?质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometer,LC-MS)分析。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium

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Figure3The schematic of the synthesis of tumor targeted CdTe quantum dots modified with functional polymer

dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)进一步考察量子点表面配体共价偶联的结构特征。紫外、荧光光谱分析将制得的9R/DG-coated CdTe QDs纳米粒溶于磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution,PBS)中,然后用紫外?可见分光光度计和荧光分光光度计分别测定紫外吸收光谱和荧光发射光谱。

粒径和形貌分析制得的QDs复合纳米材料的粒径、形貌及分布通过透射电镜(transmission electron micrographs,TEM)来观察,在PBS溶液中分散均匀的纳米粒悬液滴在涂有碳支持膜的铜网上,充分干燥后在加速电压为80kV的透射电镜下观察纳米粒形态大小。

细胞毒性实验采用甲基噻唑基四唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法进行检测,选用人胶质母细胞瘤(U87)、人肝癌细胞系(HEPG2)、人胃癌细胞系(SGC-7901)、人乳腺癌细胞系(MCF-7)和人脐静脉内皮细胞株(EaHy926)。按细胞数(5×103/ mL)200μL接种于96孔板,RPMI1640培养基培养,并在37℃、二氧化碳浓度为5%和加湿空气环境下孵育。随后,每孔中的培养基用含有不同浓度(0.01、0.1、1、10、100和1000μmol·L?1)纳米载体的新鲜RPMI1640培养基替换,继续孵育48h。不含纳米载体的新鲜培养基替换原有孔中的培养基,作为空白对照组。48h后,所用孔中的培养基用180μL新鲜RPMI1640和20μL MTT溶液(5mg·mL?1)替换,继续培养4h。最后,将所有孔中的培养基倒出,每孔加入DMSO200μL,并在室温下轻轻振摇。每孔中的溶液在490nm处的吸光值可用酶标仪进行测定。各组的细胞相对存活率可通过如下公式进行计算:存活率(%)=(OD treated/OD control)×100%,其中OD treated表示加入一定浓度壳聚糖胶束样品的实验组吸光值,而OD control表示空白组(未加入壳聚糖胶束样品)的吸光值。

细胞摄取实验逆转录聚合酶链式反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测肿瘤细胞表面葡萄糖转运体1(glucose transporter type1,GLUT1)受体的表达在37℃、二氧化碳浓度为5%和加湿空气环境下培养U87MG(DMEM培养基)、HEPG2、SGC-7901和MCF-7(RPMI1640培养基)4种细胞系。用总RNA提取试剂盒(Rneasy Total RNA Kit)提取两种肿瘤细胞中的总RNA,然后用SuperScript TM III逆转录试剂盒将3μg RNA逆转录成cDNA,以β-actin作为内参,取cDNA1μL进行PCR 循环,扩增GLUT1基因。PCR扩增条件为:95℃预变性10min→94℃45s→60℃45s→72℃1min (循环30次)→72℃延伸5min。GLUT1引物序列为:上游引物:5'-CAACCGCAACGAGGAGAAC-3',下游引物:5'-ACAGCGACACGACAGTGAAG-3',产物长度为329bp。内参β-actin的引物序列为:上游引物: 5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3',下游引物: 5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3',产物长度为285bp。取5μL扩增产物用于1.2%(w/v)琼脂糖凝胶电泳分析。

肿瘤细胞靶向摄取实验24孔培养板的每个孔中加入0.5mL RPMI1640或DMEM培养基培养的U87、HEPG2、SGC-7901和MCF-7细胞系(5×105 cells·mL?1)。在37℃、二氧化碳浓度为5%和加湿空气环境下孵育24h。然后在每孔中换入0.5mL含有量子点复合纳米粒的RPMI1640培养基。继续孵育30min后将培养基去除,用PBS溶液清洗3遍,最后用荧光倒置显微镜观察细胞内纳米粒的摄取情况。

结果与讨论

1表面配体的合成及鉴定

量子点表面修饰配体的合成,即首先通过化学合成的方法制备得到硫辛酸?赖氨酸复合物,然后将9R的羧基端与LA-Lys中赖氨酸上的氨基反应,并进一步与预先合成的DG-PEG复合物结合,最终形成硫辛酸?赖氨酸与DG-PEG及9R连接的量子点表面的配体复合物。

纯化后的硫辛酸?赖氨酸复合物采用LC-MS分析,质谱检测得到的硫辛酸?赖氨酸(Boc)分子量(m/z433[M?H]?)与理论分子量完全一致(434)。

DG-PEG及DG-PEG-LA-Lys-9R两种复合物则使用FTIR及1H NMR检测。FTIR光谱显示:DG-PEG (Boc):1045cm?1,1110cm?1为C-O-C伸缩振动峰; 1400cm?1为酰胺上的C-N伸缩振动峰;1640cm?1为

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酰胺中的C=O 伸缩振动峰;2850cm ?1为CH 3的对称伸缩振动;2934cm ?1为CH 2的伸缩振动峰;3445cm ?1为DG 上的O-H 与PEG 上N-H 的伸缩振动吸收峰的重叠峰。DG-PEG-LA-Lys-9R:3442cm ?1为DG 上的O-H 与PEG 上N-H 的伸缩振动吸收峰的重叠峰;2360cm ?1为CO 2峰;1651cm ?1为酰胺中的C=O 伸缩振动峰加强;1400cm ?1为酰胺上的C-N 伸缩振动峰;1092cm ?1为C-O-C 的伸缩振动峰。

DG-PEG (Boc)的1H NMR 归属如下:1.26～1.45归属为Boc 上的甲基峰;2.54～2.73归属为酰胺上的亚甲基峰CH 2;3.66归属为PEG 上的亚甲基峰;3.44～3.90,4.16归属为DG;7.28～7.44为氘代氯仿(CDCl 3)溶剂峰。DG-PEG-LA-Lys-9R 的1H NMR 归属如下:1.40～2.60归属为L -赖氨酸上的亚甲基峰;3.49为PEG 上的亚甲基峰;2.50左右为DMSO 的溶剂峰;3.50左右为H 2O 峰;3.44～3.90归属为DG;1.25～2.61归属为硫辛酸上的亚甲基峰。

用纯化后的LA-Lys-9R 与DG-PEG-LA-Lys-9R 化合物进行SDS-PAGE 凝胶电泳分析(图4),以9R 作为对照,LA-Lys-9R 的电泳条带与9R 几乎在同一条直线上,说明用9R 与LA-Lys 相连后,并没有显著影响9R 的分子质量,这是因为9R (Fmoc)的相对分子质量为1549,与LA-Lys 相连后得到的LA-Lys-9R (Fmoc)的相对分子质量为1865,故可以忽略不计。而DG-PEG-LA-Lys-9R (Fmoc)复合物的相对分子质量达到3994,与9R 相比明显增加。因此,在SDS-PAGE 凝胶电泳上DG-PEG 与DG-PEG-LA-Lys-9R (Fmoc)复合物的电泳条带明显落后于9R 电泳条带,进一步证明了DG-PEG 与LA-Lys-9R 通过共价键成

功地偶联。

Figure 4

SDS-PAGE of 9R,LA-Lys-9R,and DG-PEG-LA-

Lys-9R

2光谱鉴定

采用紫外和荧光光谱分别测定CdTe QDs 、9R 修

饰的CdTe QDs (9R-coated CdTe QDs)、DG 修饰的CdTe QDs (DG-coated CdTe QDs)及9R 和DG 共同修饰的CdTe QDs (9R/DG-coated CdTe QDs),结果如图5所示。9R/DG 与CdTe QDs 表面的有机配体发生交换后,形成9R/DG 修饰的CdSe/ZnS QDs 的紫外吸收峰和荧光发射峰与原始CdTe QDs 比较发生了少量红移,吸收峰从480nm 移至510nm,发射峰从627nm 移至659nm,峰的宽度几乎没有变化。一般来说,QDs 尺寸的增加会引起吸收峰和发射峰发生红移,9R/DG 的表面修饰使得QDs 的尺寸增加,进而导

致紫外吸收峰和荧光发射峰都发生红移。

Figure 5Absorption and PL spectra of CdTe QDs,9R-coated CdTe QDs,DG-coated CdTe QDs,and 9R/DG-coated CdTe QDs

3形貌检测

高分辨透射电镜照片(图6)显示,CdTe QDs 、

9R 修饰的CdTe QDs 、DG 修饰的CdTe QDs 以及9R/DG 共同修饰的CdTe QDs 均呈球形,尺寸均一,分散性较好。其中,CdTe QDs 平均粒径约为3nm;9R 修饰的CdTe 量子点平均粒径为4～5nm;DG 修饰的CdTe 量子点平均粒径为6～7nm;9R/DG 共同修饰的

CdTe QDs 的平均粒径为8～10nm 。这些进一步证明了量子点荧光发射波长与其粒径尺寸相关。TEM 图

?

1462?药学学报Acta Pharmaceutica Sinica 2014,49(10):1457?1465

片中粒子的粒径可能小于纳米粒在水相中的粒径,这是因为量子点表面的生物材料具有一定的溶胀性。在TEM 点样过程中,随着水分的蒸发,粒子出现了一定程度的收缩[21,22]

。

Figure 6TEM of CdTe QDs (A),9R-coated CdTe QDs (B),

DG-coated CdTe QDs (C),and 9R/DG-coated CdTe QDs (D)

4肿瘤细胞表面GLUT1受体的表达

为了研究量子点的细胞毒性、细胞摄取能力与

细胞表面GLUT1受体表达高低之间的相互关系,采用PT-PCR 技术检测U87MG 、HEPG 2、SGC-7901和MCF-7细胞表面GLUT1受体的表达(图7),结果表明,HEPG 2、SGC-7901细胞表面GLUT1受体高表达,然而在U87MG 和MCF-7细胞表面却几乎没有GLUT1

受体的表达。

Figure 7GLUT1receptor expression levels of MCF-7,SGC-7901,U87MG,and HEPG 2cells by Reverse Transcriptase PCR

5细胞毒性实验

选用U87MG 、HEPG 2、SGC-7901、MCF-7和

EaHy926细胞观察量子点的体外细胞毒性。QDs 在生物方面的应用取决于其对细胞功能及细胞活性的影响。QDs 在体内应用中遇到的最大问题是其毒性,因为QDs 本身会释放Cd 2+离子。QDs 的毒性不仅取决于自由Cd 2+离子的浓度,还与Cd 2+离子是否被细胞吸收及粒子在细胞内分布的位置密切相关[23]。已有研究证明,用生物分子包覆QDs,可以减少其表面自

由Cd 2+离子的释放,进而减少QDs 的毒性[24,25]。采用U87MG 、HEPG 2、SGC-7901、MCF-7肿瘤细胞和EaHy926人脐静脉内皮细胞的成活率测试9R/DG 共同修饰的CdTe QDs 的细胞毒性。结果表明,9R/DG-coated CdTe QDs 的生物毒性很小,在最高浓度(1000μmol·L ?1)下,5种细胞的相对活力未见明显下降(图8)。与CdTe QDs 相比,9R/DG 修饰的CdTe QDs 对正常细胞的成活率影响不大。在最高浓度下,EaHy926细胞的存活率依然达到97%以上。U87MG 和MCF-7是两种GLUT1低表达的肿瘤细胞,而HEPG 2和SGC-7901细胞分别是GLUT1高表达的人肝癌细胞和人胃癌细胞。9R/DG 修饰的CdTe QDs 对4种肿瘤细胞存活率比单纯CdTe QDs 也有明显的提高,这可能是修饰的CdTe QDs 在生物体中比较稳定、向溶液中释放的Cd 2+离子比较少。其中,9R/DG 修饰的CdTe QDs 对HEPG 2和SGC-7901细胞的毒性明显高于U87MG 、MCF-7细胞。这可能与9R/DG 修饰的

CdTe QDs 对GLUT1受体高表达的癌细胞具有比较高的识别能力,进入HEPG 2和SGC-7901细胞中的量比较大有关。本研究结果基本验证了9R/DG-coated CdTe QDs 具有无毒、安全性好的特点。6荧光显微镜观察各组量子点纳米粒的细胞摄取实

验

荧光显微镜成像技术被用于研究各组量子点纳米粒的细胞摄取,结果见图9。CdTe QDs 与肿瘤细胞共同孵育后,CdTe QDs 几乎都不能被这4种肿瘤细胞摄取;9R 修饰的CdTe QDs 在4种细胞内均发出红色荧光;DG 修饰的CdTe QDs 与肿瘤细胞共同孵育后,U87MG 和MCF-7细胞内几乎未见显著荧光,而HEPG 2和SGC-7901细胞内可见大量红色荧光;9R/DG 共同修饰的CdTe QDs 同样也在HEPG 2和SGC-7901肿瘤细胞内发出强烈的红色荧光,但其他两种肿瘤细胞内少见红色荧光。

Warburg 等[26?28]发现肿瘤局部在有氧环境中存在异常旺盛的无氧葡萄糖酵解现象,尤其在乏氧条件下,肿瘤细胞的代谢途径发生了改变,从对氧气消耗较多的氧化磷酸化更多地转向可以在无氧条件下进行糖酵解,由此乏氧肿瘤细胞表面的葡萄糖转运体表达异常增加,以摄取大量的葡萄糖。已有研究证实将葡萄糖的衍生物DG 与药物或纳米粒连接后,与肿瘤细胞表面高表达的葡萄糖转运体结合,可实现肿瘤的靶向传输[29]。细胞穿膜肽是具有穿膜能力的一种多肽,能够运载生物大分子跨越细胞膜进入细胞

[30]

。目前研究最为活跃的当属富含精氨酸的细胞

朱红艳等:肿瘤靶向高分子碲化镉量子点复合纳米粒的制备及其表征?1463?

Figure8Cytotoxicity study of CdTe QDs and9R/DG-coated CdTe QDs

Figure9Fluorescence microscopy images of MCF-7,SGC-7901,U87MG,and HEPG2cells incubation for30min with CdTe QDs, 9R-coated CdTe QDs,DG-coated CdTe QDs,and9R/DG-coated CdTe QDs

?1464?药学学报Acta Pharmaceutica Sinica2014,49(10):1457?1465

穿膜肽。当连接精氨酸数目在5～11个之间时,多肽分子即可表现出穿膜性能,而由9个D-精氨酸组成的多肽9R被证实具有最好的穿膜效果[31,32]。

本实验结果证实DG靶向修饰的CdTe QDs可以通过GLUT1受体介导的吞噬途径进入GLUT1受体高表达的HEPG2和SGC-7901细胞。U87MG和MCF-7细胞表面GLUT1受体的表达非常低,因此, DG修饰的CdTe QDs被U87MG和MCF-7细胞摄取的能力很弱。但9R对细胞缺乏选择性,虽然9R修饰的CdTe QDs可以穿透4种肿瘤细胞的细胞膜进入细胞浆中,由于缺乏DG的靶向修饰,单纯9R修饰的CdTe QDs对肿瘤细胞缺乏靶向性,不能很好地识别及靶向肿瘤细胞。而9R/DG共同修饰的CdTe QDs 可以通过DG的靶向识别作用被GLUT1受体高表达的HEPG2和SGC-7901细胞摄取,然后通过9R的穿膜作用将CdTe QDs纳米粒有效地输送到肿瘤细胞内,从而进一步增加肿瘤细胞的摄取率。

结论

本研究制备的9R/DG-coated CdTe QDs复合纳米粒不但具有较好的形貌特征、光学性能,还能进一步改善量子点的生物相容性。尤其该复合纳米载体提高了GLUT1受体高表达的肿瘤细胞的靶向性,同时增加了量子点穿过细胞膜进入细胞浆的作用。9R/DG-coated CdTe QDs复合纳米粒可望用于肿瘤的靶向诊断或靶向治疗。

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