4病毒血清学实验方法
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的病毒抗血清液与等量的标准病毒液混合，接 种敏感细胞，观察CPE。 病毒抗体滴度的确定：抗血清保护细胞免受病 毒感染的最高稀释倍数的倒数。即抑制CPE的 最高稀释倍数的抗血清中，每单位体积含一个 抗体单位。
（一）试验材料
如观察结果是1：10至1：320抗血清均能抑制 病毒的CPE，也就是当抗血清稀释到320倍时， 0.1ml抗血清含有1个抗体单位，试问1：160 （2单位）及1：40（8单位）含有几个抗体单 位？
–应用
鉴定病毒； 分析病毒抗原的性质； 测定免疫血清抗体效价及疫苗效果； 测定病人血清中的抗体，用于诊断疾病。
一、基本原理
中和抗体存在使病毒不能吸附和穿入宿主细胞，使病 毒失去感染力。
当病毒与抗体混合后，接种敏感宿主细胞再观察敏感 宿主的情况，即观察残存的病毒对宿主的感染力。 对敏感动物观察动物是否免于死亡、瘫痪等； 对细胞主要观察能够抑制CPE或空斑形成； 对鸡胚培养观察绒毛膜上是否有痘疮结构或血 凝试验检测。
用中和试验方法鉴定病毒时，将不同稀释倍 数的病毒与标准的抗血清(20个抗体单位/单 位体积)混合、孵育，使二者充分反应，然 后将混合液接种到敏感宿主体内，观察试验 结果。
–试验材料
宿主:敏感细胞和动物、鸡胚； 标准抗病毒血清(20个抗体单位/0.1ml);病毒分 离物。
–试验步骤
不同浓度病毒液与等量的抗病毒血清混合细胞 培养液倍比稀释病毒；
第六章 病毒血清学实验方法
第一节、中和试验
（neutralization test)
概念：体外将病毒与特异抗体混合并 发生反应，再将混合物接种至敏感的 宿主体内，然后测定残存病毒感染力 的方法。
– 中和抗体：凡与病毒抗原结合使病毒失去 感染力的抗体。
–优点
敏感性和特异性高； 中和抗体在体内存在时间长。
CPE孔 数/接 种孔数
0/4
累计数
CPE阳
CPE数 无CPE数 性比例
0
8
0/8
1/4
1
4
1/5
CPE阳性率 （％）
0.0 20.0
1：64 3/4
4
1
4/5
80.0
1：128 4/4
8
0
8/8
100.0
距离比例＝（50%—小于50%的CPE阳性率）/ （大于50%的CPE阳性率－小于50%的CPE阳性率） ＝（50－20）/（80－20）＝0.5
取0.6ml或阴性血清混合； 接种细胞,每稀释度接5孔,设5孔正常细胞对照
CO2孵箱观察CPE； 中和试验病毒CCID50的计算:当抗血清组的
CCID50与阴性组之差的对数大于2,才说明中和 试验阳性。
用Reed-Muench计算 表：阴性血清病毒CCID50的计算
病毒稀 释度
10-4
CPE孔 数/接 种孔数
＝（71－50）/（71－29）＝0.5
大于50%的CPE阳性率血清稀释度的对数+距离比例×稀释 系数的对数=lg10-3+0.5 ×lg0.1=-3.5,其反对数是10-3.5。
阳性血清组的病毒CCID50为10-3.5/0.1ml。
因抗血清组的CCID50为10-3.5，阴性血清组的病毒 CCID50为10-5.5,所以10-3.5-10-5.5=2,表明分离的病毒 是与中和抗体相对应的病毒。
中和试验的抗体浓度为20个抗体单位/0.1ml。
（一）试验材料
宿主
— 常用为细胞培养、鸡胚和动物； — 细胞培养:观察CPE和空斑（最理想和常用）； — 鸡胚：观察鸡胚的死亡（流感）、绒毛尿囊
腔上痘疮及血凝现象（天花、牛痘、HSV）； — 小白鼠:成年和幼鼠易感，如乙脑病毒、森林
脑炎病毒。
（二）试验方法
固定病毒－稀释抗血清法
用于血清抗体滴度的测量。将100 CCID50/单位体 积的病毒分别与连续倍比稀释的病人急性期或恢复 期血清混合孵育1h后，把混合液接种于敏感宿主， 然后观察不同稀释度的血清保护宿主感染病毒的情 况。
（二）试验方法
–试验材料:
敏感宿主；标准滴定的病毒100TCID50/0.1ml;急 性期或恢复期血清。
–试验步骤
细胞培养液倍比稀释急性或恢复期血清； 取不同稀释浓度血清与标准病毒混合并37度水浴 1h取混合液0.2ml接种细胞,CO2孵箱观察CPE。
–50％血清中和终点计算：50%细胞不产生 细胞病变的血清稀释度。
用Reed-Muench计算 表： 恢复期血清中和病毒的结果
血清稀 释度
1：16 1：32
5/5
累计数 CPE数 存活数
10
0
CPE阳性比 例
10/10
CPE阳性率 （％）
100.0
10-5
4/5
5
1
5/6
83.0
10-6
1/5
1
5 1/6
17.0
10-7
0/5
0
10 0/10
0
距离比例＝（大于50%的CPE阳性率—50%）/（大 于50%的CPE阳性率－小于50%的CPE阳性率）＝ （83－50）/（83－17）＝0.5
二、方法与步骤
（一）试验材料
病毒
必须是具有感染力的病毒，先进行病毒 滴度的测定。
细胞培养，将病毒10倍稀释接种敏感细 胞，观察CPE，确定滴定终点以CCID50 或LD50表示。
标准病毒试验浓度：100 CCID50/单位 体积或100 LD50/单位体积。
（一）试验材料
抗体
包含病毒抗体阳性和阴性血清。 用细胞培养法测病毒抗体的滴度：将倍比稀释
50%血清中和终点的范围:1:32与1:64之间。
中和终点浓度=小于50%的CPE阳性率血清稀释 度的对数+距离比例×稀释系数的对数=lg101.5+0.5 ×lg0.5=-1.65,其反对数是1/45。
即50%血清中和终点为1:45,当1:45的恢复期血 清可保护50%细胞不产生细胞病变效应。
固定抗血清-稀释病毒法
累计数
度
/接种孔 CPE数 存活数
数
10-2
5/5
10
0
CPE阳性比例 CPE阳性率 （％）
10/10
100.0
10-3
3/5
5
2
5/7
71.0
10-4
2/5
2
5
2/7
29.0
10-5
0/5
0
Байду номын сангаас10
0/10
0
距离比例＝（大于50%的CPE阳性率—50%）/（大于50%的CPE 阳性率－小于50%的CPE阳性率）
lgCCID50=大于50%的CPE阳性率血清稀释度的对 数+距离比例×稀释系数的对数=lg10-5+0.5 ×lg0.1=-5.5,其反对数是10-5.5.
阴性血清组的病毒CCID50为10-5.5/0.1ml。
用Reed-Muench计算 表： 阳性组血清病毒CCID50的计算
病毒稀释 CPE孔数
（一）试验材料
如观察结果是1：10至1：320抗血清均能抑制 病毒的CPE，也就是当抗血清稀释到320倍时， 0.1ml抗血清含有1个抗体单位，试问1：160 （2单位）及1：40（8单位）含有几个抗体单 位？
–应用
鉴定病毒； 分析病毒抗原的性质； 测定免疫血清抗体效价及疫苗效果； 测定病人血清中的抗体，用于诊断疾病。
一、基本原理
中和抗体存在使病毒不能吸附和穿入宿主细胞，使病 毒失去感染力。
当病毒与抗体混合后，接种敏感宿主细胞再观察敏感 宿主的情况，即观察残存的病毒对宿主的感染力。 对敏感动物观察动物是否免于死亡、瘫痪等； 对细胞主要观察能够抑制CPE或空斑形成； 对鸡胚培养观察绒毛膜上是否有痘疮结构或血 凝试验检测。
用中和试验方法鉴定病毒时，将不同稀释倍 数的病毒与标准的抗血清(20个抗体单位/单 位体积)混合、孵育，使二者充分反应，然 后将混合液接种到敏感宿主体内，观察试验 结果。
–试验材料
宿主:敏感细胞和动物、鸡胚； 标准抗病毒血清(20个抗体单位/0.1ml);病毒分 离物。
–试验步骤
不同浓度病毒液与等量的抗病毒血清混合细胞 培养液倍比稀释病毒；
第六章 病毒血清学实验方法
第一节、中和试验
（neutralization test)
概念：体外将病毒与特异抗体混合并 发生反应，再将混合物接种至敏感的 宿主体内，然后测定残存病毒感染力 的方法。
– 中和抗体：凡与病毒抗原结合使病毒失去 感染力的抗体。
–优点
敏感性和特异性高； 中和抗体在体内存在时间长。
CPE孔 数/接 种孔数
0/4
累计数
CPE阳
CPE数 无CPE数 性比例
0
8
0/8
1/4
1
4
1/5
CPE阳性率 （％）
0.0 20.0
1：64 3/4
4
1
4/5
80.0
1：128 4/4
8
0
8/8
100.0
距离比例＝（50%—小于50%的CPE阳性率）/ （大于50%的CPE阳性率－小于50%的CPE阳性率） ＝（50－20）/（80－20）＝0.5
取0.6ml或阴性血清混合； 接种细胞,每稀释度接5孔,设5孔正常细胞对照
CO2孵箱观察CPE； 中和试验病毒CCID50的计算:当抗血清组的
CCID50与阴性组之差的对数大于2,才说明中和 试验阳性。
用Reed-Muench计算 表：阴性血清病毒CCID50的计算
病毒稀 释度
10-4
CPE孔 数/接 种孔数
＝（71－50）/（71－29）＝0.5
大于50%的CPE阳性率血清稀释度的对数+距离比例×稀释 系数的对数=lg10-3+0.5 ×lg0.1=-3.5,其反对数是10-3.5。
阳性血清组的病毒CCID50为10-3.5/0.1ml。
因抗血清组的CCID50为10-3.5，阴性血清组的病毒 CCID50为10-5.5,所以10-3.5-10-5.5=2,表明分离的病毒 是与中和抗体相对应的病毒。
中和试验的抗体浓度为20个抗体单位/0.1ml。
（一）试验材料
宿主
— 常用为细胞培养、鸡胚和动物； — 细胞培养:观察CPE和空斑（最理想和常用）； — 鸡胚：观察鸡胚的死亡（流感）、绒毛尿囊
腔上痘疮及血凝现象（天花、牛痘、HSV）； — 小白鼠:成年和幼鼠易感，如乙脑病毒、森林
脑炎病毒。
（二）试验方法
固定病毒－稀释抗血清法
用于血清抗体滴度的测量。将100 CCID50/单位体 积的病毒分别与连续倍比稀释的病人急性期或恢复 期血清混合孵育1h后，把混合液接种于敏感宿主， 然后观察不同稀释度的血清保护宿主感染病毒的情 况。
（二）试验方法
–试验材料:
敏感宿主；标准滴定的病毒100TCID50/0.1ml;急 性期或恢复期血清。
–试验步骤
细胞培养液倍比稀释急性或恢复期血清； 取不同稀释浓度血清与标准病毒混合并37度水浴 1h取混合液0.2ml接种细胞,CO2孵箱观察CPE。
–50％血清中和终点计算：50%细胞不产生 细胞病变的血清稀释度。
用Reed-Muench计算 表： 恢复期血清中和病毒的结果
血清稀 释度
1：16 1：32
5/5
累计数 CPE数 存活数
10
0
CPE阳性比 例
10/10
CPE阳性率 （％）
100.0
10-5
4/5
5
1
5/6
83.0
10-6
1/5
1
5 1/6
17.0
10-7
0/5
0
10 0/10
0
距离比例＝（大于50%的CPE阳性率—50%）/（大 于50%的CPE阳性率－小于50%的CPE阳性率）＝ （83－50）/（83－17）＝0.5
二、方法与步骤
（一）试验材料
病毒
必须是具有感染力的病毒，先进行病毒 滴度的测定。
细胞培养，将病毒10倍稀释接种敏感细 胞，观察CPE，确定滴定终点以CCID50 或LD50表示。
标准病毒试验浓度：100 CCID50/单位 体积或100 LD50/单位体积。
（一）试验材料
抗体
包含病毒抗体阳性和阴性血清。 用细胞培养法测病毒抗体的滴度：将倍比稀释
50%血清中和终点的范围:1:32与1:64之间。
中和终点浓度=小于50%的CPE阳性率血清稀释 度的对数+距离比例×稀释系数的对数=lg101.5+0.5 ×lg0.5=-1.65,其反对数是1/45。
即50%血清中和终点为1:45,当1:45的恢复期血 清可保护50%细胞不产生细胞病变效应。
固定抗血清-稀释病毒法
累计数
度
/接种孔 CPE数 存活数
数
10-2
5/5
10
0
CPE阳性比例 CPE阳性率 （％）
10/10
100.0
10-3
3/5
5
2
5/7
71.0
10-4
2/5
2
5
2/7
29.0
10-5
0/5
0
Байду номын сангаас10
0/10
0
距离比例＝（大于50%的CPE阳性率—50%）/（大于50%的CPE 阳性率－小于50%的CPE阳性率）
lgCCID50=大于50%的CPE阳性率血清稀释度的对 数+距离比例×稀释系数的对数=lg10-5+0.5 ×lg0.1=-5.5,其反对数是10-5.5.
阴性血清组的病毒CCID50为10-5.5/0.1ml。
用Reed-Muench计算 表： 阳性组血清病毒CCID50的计算
病毒稀释 CPE孔数