常用工具酶

1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象，就是细菌的 限制（限制酶）-修饰（甲基化酶）系统。
当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异 识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在 这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷 甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基 ，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。
增加限制酶的用量。 扩大酶反应的体积，使潜在的抑制因素被相应地
稀释。
延长酶反应的时间。 在反应混合物中加入适量的亚精胺，有利于限制
酶对基因组DNA的消化作用。
DNA的甲基化程度

大肠杆菌中的dam甲基化酶在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6 位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I不受影响 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序 列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等
3.同裂酶和同尾酶
同裂酶：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同 裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对 甲基化位点的敏感性不同。例:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一 对同裂酶 (CCGG) ，当靶序列中出现一个5-甲基胞嘧啶时 HpaⅡ不能进行切割，而MspⅠ可以。
同尾酶：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性 末端的核酸内切酶。
4.识别位点在DNA分子上出现的频率
推测酶切割位点出现的频率对于推断DNA酶切片段大小很有 用。假定4种核苷酸在DNA分子上出现的频率相同，那么靶 序列为6个核苷酸的内切酶在每46（=4096）个核苷酸中酶 切位点就有一次出现机会。据此推算，一条49000bp长的 DNA中有12个6核苷酸识别序列的酶切位点（49000/4096） 。但事实上并非真正如此，因为DNA分子中4种碱基的出现 频率并不均等。
限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核 苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它本是 微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能 是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一 种防御机制。 1970年，Smith和 Wilcox从流感嗜血 杆菌中分离纯化了 第一个II型限制性 内切酶Hind II， 使得DNA分子的体 外精确切割成为可 能。
酶的缓冲液：

氯化镁、氯化钠或氯化钾：
不正确的NaCl或Mg2+浓度，会降低限制酶的活性，还可能导 致识别序列的改变。

Tris-HCl：维持最适的pH值（pH＝7.4）。 β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：维持酶的稳定性。 牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性。
在“非最适的”反应条件下(包括高浓度的核酸内切限制 酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高 pH值等等)，有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会 发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切 割DNA分子，这叫做星号活性(star activity)。
二、连接酶的类型
大肠杆菌DNA连接酶：由大肠杆菌基因组DNA编码 ，以NAD+作为能源辅助因子； T4 DNA连接酶：由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以 ATP作为能源辅助因子，是基因工程中常用的连 接酶。
三、DNA连接反应的条件
连接反应最佳温度为37℃，但是此时粘性末端间氢键结合 不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI 粘性 末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开，所以通常在 4-15℃连接。
第三节 DNA聚合酶
一、大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA pol I）
基本特性：Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌细胞中分 离出来，它是一种多功能性的酶，包括3种不同的酶活力： 5′- 3′聚合酶活性：以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合 到引物的3′末端，并不断延伸。 5′- 3′外切酶活性：将双链DNA中游离的5′末端逐个切去。 3′- 5′外切酶活性：将游离的双链或单链DNA的3′端降解。 不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。
第二节 DNA连接酶
一、连接酶的概念
环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接DNA的 酶存在。1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种 能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶——DNA连 接酶（ligase）。 连接酶：能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（-OH）和 5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷 酸二酯键。只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap ），而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。
影响连接效率的因素
温度（最主要的因素） ATP的浓度(
10M - 1M )
连接酶浓度（平头末端较粘性末端要求高） 反应时间（通常连接过夜）
插入片段和载体片段的摩尔比（3：1）
DNA连接的策略
粘性末端DNA片段的连接

平头末端DNA片段的连接
从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端 的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子 间的连接，因此后者反应速度要慢得多，提高平头末端连接 效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连 接），加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会，加 入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用，加入单价阳 离子（NaCl），最终浓度150-200 mM。
二、限制性内切酶的分类
根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可 以将限制性内切酶分为三类：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶
三、限制性内切酶的命名
四、限制性内切酶（II型）的特性
1.基本特性
识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构
平头末端DNA片段的末端加尾连接法
平头末端DNA片段加衔接物连接法
衔接物(linker)，是人工化学合成的一段10-12个核苷酸的 DNA双链，其中包含有1个或几个限制性酶切位点。使用时 只须将衔接物和目的片段的5′端用多核苷酸激酶处理使 之磷酸化，然后用T4DNA连接酶进行连接，就可获得能产 生粘性末端的DNA片段。
3 常用工具酶
第一节 限制性核酸内切酶
第二节 DNA连接酶
第三节 DNA聚合酶
第四节 核酸酶
第五节 修饰酶
第一节 限制性核酸内切酶
一、限制酶的发现
20世纪30年代， 微生物学家发现， 微生物的噬菌体 不能交叉感染， 如E coli K株的 噬菌体只能感染 E coli K株，不 能感染其他株， 反之亦然。
单链核酸外切酶： 核酸外切酶VII（ ExoVII） 双链核酸外切酶： 核酸外切酶III（ ExoIII）,从3’端 外切
双链核酸外切酶： λ 核酸外切酶（ λ Exo）,从5’端 外切
第五节 修饰酶
碱性磷酸酶：将DNA或RNA5′端的磷酸切除。小牛胸腺碱 性磷酸酶（CIP），大肠杆菌碱性磷酸酶（BAP）


哺乳动物中的甲基化酶在5’CG3’序列中的C5位上引入甲基
1）重新设计引物； 2）选用不受dam和dcm甲基化影响的同裂酶； 3）使用dam、dcm甲基化酶突变的宿主菌（例如GM33、JM110） 进行DNA的转化； 4）酶切PCR产物，此时酶切位点外侧需要加保护碱基。
DNA的分子结构 某些限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比 消化线性的DNA高20倍。 酶切反应的温度：大多数酶的标准反应温度为37度
三、T4 DNA聚合酶
基本特性：

5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性 在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切


在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止
在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位
基本用途： 切平由核 酸内切酶 产生的3’ 粘性末端
DNA片段的 同位素末 端标记
CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCG AT AGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT T GGCTA
4.限制酶对DNA的局部消化
想获得平均分子量大小有所增加的限制片段产物，可以进行不 完全的限制酶消化反应。
a. 缩短酶切的消化反应的保温时间
b. 降低反应的温度（37-4）。 5.终止反应：加EDTA或SDS，65℃保温20min，酚-氯仿抽提； 6.操作中注意事项 a.混匀反应液可以用移液器吹打或轻弹管壁，然后瞬时离心 ，尽量避免强烈振荡； b.限制酶应分成小份，避免反复冻融 c.酶一般保存在含50%甘油的贮存缓冲液中，酶液体积不超过 反应体积的1/10，同时尽量减小反应体积 d.取酶液时，注意移液器的准度
五、限制性核酸内切酶的酶切反应 1.酶单位（U）的定义：在理想的反应条件（适宜 的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，1h完全 降解1 g DNA所需要的酶量。 2.反应条件：大多数限制酶反应条件如下
双 酶 切
3.影响限制酶活性的因素 DNA样品的纯度：蛋白质、酚、氯仿、酒精、 EDTA、SDS、以及高浓度的盐离子等
基本用途：
二、大肠杆菌DNA聚合酶I 大片段（Klenow）
大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分 之二的大肽段，即为Klenow酶。 基本特性：拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’ →5’的 核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。 基本用途： 补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端 DNA片段的同位素末端标记 cDNA第二链的合成 双脱氧末端终止法测定DNA序列
四、逆转录酶（反转录酶） 基本特性：
以RNA为模板 聚合cDNA链
双向外切 DNA-RNA杂合 链中的RNA链 AMV逆转录酶； M-MLV逆转录酶
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第四节 核酸酶
RNase A：核酸内切酶，水解RNA RNase H：核酸内切酶，水解RNA-DNA杂交链中的RNA DNase I：随机切割单链或双链DNA S1核酸酶：来自稻谷曲霉（Aspergillus oryzae），可以 降解单链DNA或RNA的内切酶。用于将粘性末端水解成平头 末端及cDNA发夹式结构的处理。
主要用途有： A、在用P标记DNA 5′端之前，去除5′端的P； B、在DNA重组技术中，去除DNA片段的5′磷酸，防止载体的 自身环化。
T4-多核苷酸磷酸激酶：在DNA、RNA的5’-OH上加磷酸
末端转移酶（TdT）：来自小牛胸腺不需要模板的DNA聚合 酶，随机掺入dNTPs
2.限制性内切酶作 用后的断裂方式 粘性末端 ：因 酶切位点在两条 DNA单链上不同 ，酶切后形成具 有互补碱基的单 链末端结构，酶 切产生的两个粘 性末端很容易通 过互补碱基的配 对而重新连接。
平头末端：因酶切位点在两条DNA单链上相同， 酶切后形成平齐的末端结构，这种末端不易重新 连接。