纤维素酶的研究及应用-酶工程论文.

纤维素酶的研究及应用

摘要：我国纤维素酶的应用研究近年来取得了很大进展。本文阐述了纤维素酶的发展，菌种选育，酶的结构，反应机制以及在生活中的应用。关键词：绿色化 催化域 结合区 C1-Cx假说

一、纤维素酶的发展

资源和环境问题是人类在21世纪面临的最主要的挑战。生物质资源是可再生性资源，地球上年光合作用的产物高达1.5×1011~2.0×1011t，是人类社会赖以生存的基本物质来源。其中90%以上为木质纤维素类物质。目前这部分资源尚未得到充分的开发利用。随着世界人口迅速增长、矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重要的意义和光明的发展前景。

纤维素酶的研究，自从1904年在蜗牛消化液中被发现，至今已经历三个发展阶段。第一阶段是80年代以前，主要工作是利用生物化学的方法对纤维素酶进行分离纯化。但由于纤维素酶来源广泛、组分复杂、纯化甚为困难，故进展缓慢。第二阶段是1980年至1988年，主要工作是利用基因工程的方法对纤维素酶的基因进行克隆和一级结构的测定。Trichoderma reesei的内切酶（EGⅠ、EGⅢ）和外切酶（CBHⅠ、CBHⅡ）、Cellulomonas fimi的内切酶（CenA、CenB、CenC、CenD）和外切酶（CbhA、CbhB、Cex）、Clostridium thermocellum的内切酶（CelA、CelB、CelC、CelD）的基因已被克隆和测序，并在大肠杆菌，酵母菌等中得到表达。第三阶段是1988年至今，主要工作是利用结构生物学及蛋白质工程的方法对纤维素酶分子的结构和功能进行研究，包括纤维素酶结构域的拆分、解析、功能性氨基酸的确定、水解的双置换机制的确立，分子折叠和催化机制关系的探讨。

二、纤维素酶菌种选育

纤维素分解菌的筛选方法主要有纤维素选择培养基法、滤纸底物和纤维素天青培养基法、半固体纤维素天青试管法、《P-N》法和纤维素刚果红培养基法等。其中，纤维素刚果红培养基在对纤维素分解菌的准确识别方面具有明显的优越性。纤维素是由葡萄糖残基以β-1.4糖苷键连接而成的线状大分子物质，在纤维素酶的作用下水解成纤维二糖和葡萄糖，水解后的糖类与刚果红染料形成红色沉淀，使产酶菌株的菌落周围出现清晰的红色水解圈。根据水解圈的大小，可以粗略地估计菌株产酶的情况，提高工作效率。产纤维素酶的微生物包括真菌、细菌和放线菌。其中主要的有：康氏木霉、黑曲霉、斜卧青霉、芽孢杆菌等。丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物，而嗜碱细菌产生的纤维素酶在碱性范围起作用。

三、酶的分子结构

1　纤维素酶分子结构域的拆分

[1]用木瓜蛋白酶有限酶切Trichoderma reesei的 1986年Tilbeurgh

CBHⅠ分子得到具有独立活性的两个结构域：一个是具有催化功能的催化域（catalytic domain,CD），另一个是具有结合纤维素功能的纤维素结合（吸附）区（cellulose binding domain,CBD），之后用类似的方法在多种细菌和真菌的纤维素酶中发现类似的结构。CBD在纤维素酶中位于氨基端或羧基端，它通过一段高度糖基化的linker与催化区相连。

细菌纤维素酶的linker富含Pho、Thr，而真菌纤维素酶的linker富含Gly、Ser、Thr；细菌纤维素酶的CBD与CD夹角为135°，而真菌为180°；细菌纤维素酶有两个酶切位点可将CBD与linker分别切去，而真菌纤维素酶一般只有一个酶切位点可将CBD与linker一同切去。

　由于纤维素全酶分子呈蝌蚪状、其linker高度糖基化且具有较强柔韧性，故很难得到结晶.而结构域的拆分使呈球形催化域的结晶成为可能，为纤维素酶的结构和功能研究开辟了道路。

2　催化域结构和功能的研究

[2]对T.reesei的CBHⅡ的催化

采用X光衍射的方法1990年Rouvinen

域、1992年Juy[3]对C.thermocellum的CelD的催化域、1993年Spezio[4]对T.fusca的E2的催化域、1994年Divne[5]对T.reesei的CBHⅠ的催化域进行了结晶和解析。三维结构的研究为内切酶和外切酶底物的特异性作出了合理的解释：内切酶的活性位点位于一个开放的cleft中，它可结合与纤维素链的任何部位并切断纤维素链；外切酶的活性位点位于一个长Loop 所形成的tunnel里面，它只能从纤维素链的非还原性末端切下纤维二糖。1995年Meinke[6]利用蛋白质工程的方法将C.fimi的外切酶CbhA分子的Loop删除后，发现该酶的内切酶活性果然提高，这进一步证实了上述分析。

1990年Sinnott[7]从化学机制的角度出发论述了酶催化糖基转移的机制，他认为糖苷配基的离去是涉及到两个氨基酸残基的酸碱催化的双置换反应，这实际与溶菌酶的作用机制是相似的。1988年至1994年采用定点突变技术和酶专一性抑制剂做了大量研究[8~12]，终于证明Glu位于细菌、真菌的内切酶、外切酶、葡萄糖苷酶的活性位点；在异头碳原子位通过构型的保留或构型的转化完成催化反应, 其中两个保守的羧基氨基酸分别作为质子供体和亲核试剂[13，14]水解双置换机制得以证明。

3 纤维素结合（吸附）区结构和功能的研究

自从1986年Tilbeurgh用木瓜蛋白酶有限酶切T.reesei的CBHⅠ分子发现CBD以来，之后用类似的方法和序列缺失的方法在多种细菌、真菌的纤维素酶和半纤维素酶中发现了CBD。1995年Tomme[15]根据CBD分子大小及氨基酸的相似性将已知的CBD分成了10个家族，大部分的CBD位于家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。家族Ⅰ的CBD包括33～40个氨基酸残基，所有真菌的CBD都属于家族Ⅰ；家族Ⅱ的CBD包括95～108个氨基酸残基，C.fimi的CBD都属于家族Ⅰ；家族Ⅲ的CBD位于那些能产生纤维小体的梭菌中。