第十三章分子生物学技术
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第十三章分子生物学技术
第一节、重组DNA技术-基因工程 第二节、分子杂交及相关技术 第三节、聚合酶链反应的原理和应用 第四节、基因定位的常用方法
1
分子生物学技术
70年代以来,分子生物学技术迅速发展起 来,使人们有可能进行人类基因组及单个 基因的结构研究,分析其功能特征,了解 其变化规律。分子生物学技术为揭示人 类遗传病的本质起着重要作用。下面就 一些分子生物学技术予以介绍。
2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有 单一切点；
3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响 其复制能力，并有可选择的标记基因（如， 抗药基因）。
常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC， YAC，PI等。
14
（一）.质粒plasmid
Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。
重组DNA技术（Recombinant DNA Technique） 是人类根据需要选择目的基因（DNA片段） 在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞 或生物体内，以达到改良和创造新的物种和 治疗人类疾病的目的。
这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的 发现和应用。
4
一、限制酶
限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地 切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手 术刀”）。
兰色。从而筛选阳性菌落。
EcoRI
HindIII
LacZ
pUC19
APR
Ori复制起 点
16
（二）.λ-噬菌体(λphage)
是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染 大肠杆菌.λ-噬菌体DNA是线状双链DNA分子, 全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末 端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久， COS序列碱基配对环化。
1975DNA杂交
现代分子遗传学发展 重要事件
1977DNA测序 1981转G小鼠
1985PCR
1987G剔除小鼠 1989位置克隆
1990第一个基因治疗 1995细菌G组序列
3
第一节 重组DNA技术-基因工程
重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最 重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。
发现于原核生物体内，现已分离出100多种， 几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组 DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。
5
1、限制酶的命名
根据其来源命名。如： 属名 菌株名
E co R I
种名
编号
EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I 指在该菌株中分离的第一个限制酶。
6
2、限制酶识别序列和切割形成
20
(四) 大片段DNA克隆载体
人类和哺乳动物的基因组很大，甚 至许多单个基因也相当大（如：DMD gene 2300kb） ，克隆分析就需要 更大的基因载体。如近年来构建的 一些载体：BAC，PI，YAC等。
21
1、细菌人工染色体（bacterial artificial
chromosome,BAC）
9
互补末端连接
10
产生相同序列的突出末端的不同片段 可有三种方式：
1)用同一种限制酶切割； 2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割； 3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘
性末端的限制酶切割。
11
3、特点：
根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断 中的重要用途：
1) 不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产 生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属 的DNA重组。如人和质粒DNA等。
改建后的λ噬菌体发展了多种较大型的克隆 载体，如：
17
1、置换λ载体 – 溶解途径 载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。
可克隆23kb的外源DNA。 2、插入λ载体 – 裂解途径
DNA在宿主细胞中复制，然后包装成 噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可 克隆5kb的cDNA。
18
裂 解 途 径
2) 用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位 点。
3) Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变 酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。
12
二、基因运载体及其选择
载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细 胞，并能自我复制和增殖的工具。
13
载体具以下特征：
1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进 入宿主细胞并在其中增殖；
2
1956HbsGlu-Val 1944DNA是遗传物质
1996酵母基因组序列
1972重组质粒
1986位置克隆
第一个R酶 1983HD病G定位
1946 1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995
1949Hbs贫血 1953双螺旋
1966遗传密码
优点：能携带大片段DNA， 约300kb。
在每个细胞中，一个载 体分子能繁殖多个拷贝， 高产DNA。
缺点：会出现插入片段在 结构上的不稳定，导致克 隆DNA部分的缺失或重排。 为克服上述缺点，人们采 用低拷贝数复制子载体， 如，E coli中的F因子。 此质粒含有2种基因 （part A, part B）。 每个E coli能接受 >300kbDNA片段。
Plasmid
PBR322
大肠杆菌 pSC101
chromosome
COIEI
plasmid 革兰氏阴性菌 pc194
scp12
真核生物-酵母质粒
15
常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长 度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达， 增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性 丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生
19
（三）.粘粒(cosmid vector)
（30～40kb）
是将质粒和λ噬菌体改建的一种载体.它 含COS序列,插入一小plasmid –而得名 Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌体的复 制起点和cos 末端。全长8kb。大片段外 源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。 可包装30～45kb长的DNA片段，多用于基 因文库构建。
每种限制酶能识别和切割的通常4～8个核苷酸 序列，称为限制性位点或切点。
如：Hare Ⅲ 5’-GGCC-3’
Bam HI 5’-GGATCC-3` 平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差 切割形成 粘性末端（sticky end）交错切。
7
8
部 分 常 用 限 制 酶 及 切 点Байду номын сангаас
第一节、重组DNA技术-基因工程 第二节、分子杂交及相关技术 第三节、聚合酶链反应的原理和应用 第四节、基因定位的常用方法
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分子生物学技术
70年代以来,分子生物学技术迅速发展起 来,使人们有可能进行人类基因组及单个 基因的结构研究,分析其功能特征,了解 其变化规律。分子生物学技术为揭示人 类遗传病的本质起着重要作用。下面就 一些分子生物学技术予以介绍。
2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有 单一切点；
3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响 其复制能力，并有可选择的标记基因（如， 抗药基因）。
常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC， YAC，PI等。
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（一）.质粒plasmid
Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。
重组DNA技术（Recombinant DNA Technique） 是人类根据需要选择目的基因（DNA片段） 在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞 或生物体内，以达到改良和创造新的物种和 治疗人类疾病的目的。
这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的 发现和应用。
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一、限制酶
限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地 切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手 术刀”）。
兰色。从而筛选阳性菌落。
EcoRI
HindIII
LacZ
pUC19
APR
Ori复制起 点
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（二）.λ-噬菌体(λphage)
是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染 大肠杆菌.λ-噬菌体DNA是线状双链DNA分子, 全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末 端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久， COS序列碱基配对环化。
1975DNA杂交
现代分子遗传学发展 重要事件
1977DNA测序 1981转G小鼠
1985PCR
1987G剔除小鼠 1989位置克隆
1990第一个基因治疗 1995细菌G组序列
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第一节 重组DNA技术-基因工程
重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最 重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。
发现于原核生物体内，现已分离出100多种， 几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组 DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。
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1、限制酶的命名
根据其来源命名。如： 属名 菌株名
E co R I
种名
编号
EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I 指在该菌株中分离的第一个限制酶。
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2、限制酶识别序列和切割形成
20
(四) 大片段DNA克隆载体
人类和哺乳动物的基因组很大，甚 至许多单个基因也相当大（如：DMD gene 2300kb） ，克隆分析就需要 更大的基因载体。如近年来构建的 一些载体：BAC，PI，YAC等。
21
1、细菌人工染色体（bacterial artificial
chromosome,BAC）
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互补末端连接
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产生相同序列的突出末端的不同片段 可有三种方式：
1)用同一种限制酶切割； 2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割； 3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘
性末端的限制酶切割。
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3、特点：
根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断 中的重要用途：
1) 不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产 生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属 的DNA重组。如人和质粒DNA等。
改建后的λ噬菌体发展了多种较大型的克隆 载体，如：
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1、置换λ载体 – 溶解途径 载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。
可克隆23kb的外源DNA。 2、插入λ载体 – 裂解途径
DNA在宿主细胞中复制，然后包装成 噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可 克隆5kb的cDNA。
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裂 解 途 径
2) 用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位 点。
3) Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变 酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。
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二、基因运载体及其选择
载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细 胞，并能自我复制和增殖的工具。
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载体具以下特征：
1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进 入宿主细胞并在其中增殖；
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1956HbsGlu-Val 1944DNA是遗传物质
1996酵母基因组序列
1972重组质粒
1986位置克隆
第一个R酶 1983HD病G定位
1946 1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995
1949Hbs贫血 1953双螺旋
1966遗传密码
优点：能携带大片段DNA， 约300kb。
在每个细胞中，一个载 体分子能繁殖多个拷贝， 高产DNA。
缺点：会出现插入片段在 结构上的不稳定，导致克 隆DNA部分的缺失或重排。 为克服上述缺点，人们采 用低拷贝数复制子载体， 如，E coli中的F因子。 此质粒含有2种基因 （part A, part B）。 每个E coli能接受 >300kbDNA片段。
Plasmid
PBR322
大肠杆菌 pSC101
chromosome
COIEI
plasmid 革兰氏阴性菌 pc194
scp12
真核生物-酵母质粒
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常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长 度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达， 增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性 丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生
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（三）.粘粒(cosmid vector)
（30～40kb）
是将质粒和λ噬菌体改建的一种载体.它 含COS序列,插入一小plasmid –而得名 Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌体的复 制起点和cos 末端。全长8kb。大片段外 源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。 可包装30～45kb长的DNA片段，多用于基 因文库构建。
每种限制酶能识别和切割的通常4～8个核苷酸 序列，称为限制性位点或切点。
如：Hare Ⅲ 5’-GGCC-3’
Bam HI 5’-GGATCC-3` 平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差 切割形成 粘性末端（sticky end）交错切。
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部 分 常 用 限 制 酶 及 切 点Байду номын сангаас