粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法编制说明

《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法》
编制说明
《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金
快速测试卡检测方法》
标准起草组
2011年11月
《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金
快速测试卡检测方法》
编制说明
1．任务来源及工作过程
国务院粮食管理流通条例和粮食卫生标准都明确规定粮食收购要对真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行检验控制，而我国标准体系中缺少呕吐毒素快速检测的方法及标准因此，该项研究迫在眉睫。

我国是农业大国，农产品种植区分布广泛，粮食收购多集中在县以下单位的粮食收储库点。

时间短，收购量大，存在很多隐患。

主要集中在以下方面：一方面粮食入库时间短，不宜长时间露天存放，因此对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测需要快速定性。

另一方面收购企业技术力量和硬件设备不足，利用大型仪器检测收购粮真菌毒素无法普及。

因此目前在粮食收购环节最需要解的问题就是建立高效、快速、低成本的定性检测方法。

传统上，真菌毒素的分析一般采用薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)。

TLC虽然简便，但灵敏度差；HPLC虽然灵敏度高，但样品处理烦琐，操作复杂，仪器昂贵。

这两种方法都不适合在收购原粮时进行快速定性检测。

因此需要脱氧雪腐镰刀菌烯醇快速检测方法的研究，从源头解决储备粮真菌毒素污染问题。

为了确保公民的饮食安全，进一步保证产品质量、规范生产、为市场监督提供依据，需要制定《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法》标准，按照GB2760-2007的要求，对小麦粉及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量进行监督。

本行业标准的制定是根据国家粮食局标准质量中心下达的年国家标准制修订任务，由北京市粮油食品检验所负责起草。

项目编号：
2. 编制过程
第一阶段工作
第一阶段为收集国内外脱氧雪腐镰刀菌烯醇测试分析标准及相关资料，了解掌握脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定方法的最新技术发展情况阶段。

本阶段查阅了大量的文献资料，参考国内外脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定方法的国家标准和行业标准。

标准编制小组成员经过研究和讨论一致认为，胶体金快速检测方法具有较好的可操作性和实用性，因此我们参考这些先进方法和产品，并根据国内粮食行业的实际生产和检测技术应用情况，着手制定《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法》的基本思路和主要工作方向。

第二阶段工作
第二阶段为组织起草并召开标准起草组工作会议。

本标准起草组在经过收集、整理资料和调研工作的基础上，提出标准提纲，确定了标准的主要内容和要求。

标准起草工作组成员单位进行讨论、论证，形成标准初步文本；标准起草组成员单位间通过多种形式不断交流、补充、完善标准文本，进行验证试验和比对试验，最终形成该标准征求意见稿。

本阶段重点组织了脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测方法的验证试验。

先后开展了两轮比对试验，针对各家分析实际操作时标准文本中存在的问题及建议，对标准进行了修改，得到标准起草小组的一致认可，形成该标准征求意见稿。

3 编制原则
本标准按照GB/T 、GB/T 和GB/T 《标准编写规则第4 部分化学分析方法》的规定和要求编写，在标准框架、结构和内容等方面符合这些标准的要求。

强制性国家标准《粮食卫生标准》规定了粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的安全限量，且本标准所确定的检测方法能满足该标准的初步筛选测定。

4.国家标准主要内容的论据
本标准的主要内容
《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法》标准为推荐性标准，其主要内容包括：
（1）封面
（2）前言
（3）标准主体内容：范围、规范性引用文件、原理、试剂、仪器设备、样品制备、样品测定与结果判定。

主要试验（或验证）的分析
4.2.1标准方法原理
脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素胶体金快速测试卡检测技术原理是基于抗原抗体反应、免疫金标记技术及毛细管层析技术。

以微孔膜为固相载体，将可特异性识别脱氧雪腐镰刀菌烯醇的抗体标记红色或紫红色的胶体金颗粒，检测卡的膜上两个色带分别固定脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗原，以及抗鼠源性抗体的二抗，根据色带的颜色变化进行结果评估。

质控色带（control line）不会被样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇影响，而在每次反应后都应出现，用于证明检测条是否正常。

检测色带（test line）在样品中没有脱氧雪腐镰刀菌烯醇或样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量低于检测限时会显现；在样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量等于或高于检测限时不出现。

4.2.2验证方案
4.2.2.1验证对象及验证单位
参考粮食卫生标准，确定本次验证粮种为小麦和玉米，考虑到加标样品的毒素分布、均匀性等影响，本次验证全部采用天然阳性样品进行验证；验证毒素为脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）；验证用胶体金快速测试卡采用国内二家公司提供的DON三批次。

验证单位为（北京）国家粮食质量监测中心、（湖北）国家粮食质量监测中心、（辽宁）国家粮食质量监测中心、（重庆）国家粮食质量监测中心、（四川）国家粮食质量监测中心和（广西）国家粮食质量监测中心。

4.2.2.2阳性样品的制备
北京中心将收集到的阳性样品粉碎，至少80%以上通过20目筛，筛上和筛下物混匀，采用免疫亲和柱高效液相色谱法对制备的阳性样品进行混合均匀度测定，混合均匀性达到要求后将阳性样品分发给六家国家检测中心。

4.2.2.3 阳性样品定值
六家国家检测中心收到阳性样品后，采用免疫亲和柱高效液相色谱法进行平行试验测定结果报送北京中心进行统计处理，取平均值作为理论值。

4.2.2.4 测试卡验证
六家国家中心将分发并定值后的高浓度阳性样品与空白样品按照各测试卡样品量要求分别称取，配置所需浓度，然后按照测试卡说明书指定的方法进行测定。

4.2.3结果与分析
采用两种DON测试卡（测试卡A和测试卡B），各三个批次，按照各自规定的操作步骤和评定方法对小麦和玉米中DON进行了测定。

4.2.3.1 准确性
4.2.3.测试卡A
根据六家中心的检测结果，共进行39个浓度154次有效测试，共出现误判20次，判定准确率为%，其中，假阳误判出现14次，假阴误判出现6次。

具体结果见下表1。

表1 测试卡A准确性验证结果
品种测试次数误判
次数误判率% 假阴误
判次数
假阴误
判率%
假阳误
判次数
假阳误
判率%
玉米68 5 0 0 5
小麦86 15 6 9
合计154 20 6 14
4.2.3.测试卡B
根据六家中心的检测结果，共进行40个浓度187次有效测试，共出现误判34次，判定准确率为%，其中，假阳误判出现23次，假阴误判出现11次。

具体结果见下表2。

表2测试卡B准确性验证结果
品种测试次数误判
次数误判率% 假阴误
判次数
假阴误
判率%
假阳误
判次数
假阳误
判率%
玉米92 15 5 10 小麦95 19 6 13 合计187 34 11 24 4.2.3.2重复性
测试卡A：按照验证方案，六家中心共进行408次测试，其中有效结果为330次，共出现误判34次，判定准确率为%，其中假阴性误判次数为13次，出现比例为%。

测试卡B：按照验证方案，六家中心共进行414次测试，其中有效结果为316次，共出现误判61次，判定准确率为%，其中假阴性误判次数为48次，出现比例为%。

4.2.3.3稳定性
4.2.3. 测试卡A
根据有效结果，按照含量为限量标准时应判定为阳性的规则，各不同产品批次测定结果见表3。

表3 测试卡A批间稳定性
批次测试次数误判判定准确率%
24 3
20 0 100
82 4
批间相对偏差%
4.2.3.测试卡B
根据有效结果，按照含量为限量标准时应判定为阳性的规则，各不同产品批次测定结果见表4。

表4 测试卡B批间稳定性
批次测试次数误判判定准确率%
G3 30 12
G3 30 13
G2 40 12
批间相对偏差%
4.2.3.4 约定误差范围试验
测试卡A：在700-1250ppb浓度范围内，共获得14个浓度的有效测定结果108次；玉米样本无假阴性误判；小麦样本假阴性出现6次，浓度在1120-1250ppb
之间出现5次, 其中：假阴性判定出现在1000ppb浓度1次。

假阳性判定出现在800ppb浓度2次、900ppb浓度8次、950ppb浓度4次。

出现误判的浓度范围为800-1250ppb。

测试卡B：在500-1500ppb浓度范围内，共获得18个浓度的有效测定结果151次;玉米样本假阴性出现5次，浓度分别为1000ppb2次和1145ppb3次;小麦样本假阴性出现4次，浓度分别为1000ppb2次和1100ppb2次。

出现误判的浓度范围为500-1500ppb.
4.2.4结论
4.2.4.1现有国家标准方法中规定的DON测定方法精密度（见表5）。

表5 呕吐毒素检测相关标准
标准号GB/T GB/T
23503-2009 SN/T 1571-2005
标准名称食品中DON的
测定配合饲料中
DON测定
进出口粮谷中呕吐
毒素检验方法
采用方法薄层色谱ELISA 免疫亲和层析
HPLC
薄层色谱法液相色谱法
重复性% / 15 10 / /
再现性% / / / / /
检出限kg kg mg/kg 1 mg/kg
回收率% 80-100 / 70-100 /
4.2.4测试卡A性能：
准确性判定正确率：%
重复性判定正确率：%
稳定性判定正确率：%
约定误差范围（800 mg/kg~1200 mg/kg）内判断正确率：
玉米%
小麦%
综合判定正确率：80%
4.2.4.3 呕吐毒素测试卡指标设定
准确性判定误判率：结合4.2.4.1中目前国内方法的各项指标可设定为小于15% 重复性判定误判率：结合4.2.4.1中目前国内方法的各项指标可设定为小于10% 稳定性判定误判率：结合4.2.4.1中目前国内方法的各项指标可设定为小于10% 约定误差范围（800 mg/kg~1200 mg/kg）内判断误判率：
该测试卡在对玉米阳性样品的测试中，误判率明显低于对小麦样品的测试，表明性能应当能满足要求，但对小麦样品的提取机制上进一步改进，应当能解决误判率告的问题，因此将该浓度范围内的误判率定为小于15%
5.国家标准作为强制性国家标准或推荐性国家标准的建议
建议将此国家标准列为推荐性国家标准。

6.贯彻国家标准的要求和措施建议（包括组织措施、技术措施、过度办法等内容）
建议职能管理机构，指定生产部门，生产贯彻本标准以达到保护消费者权益的目的。

7.新旧国家标准的总体对比
8.技术经济论证及预期的社会经济效果
国际上少数国家针对粮食脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的检测制定了试行方法，但方法均不统一。

我国目前还未制定相关的快速筛选方法标准。

随着食品安全、粮食安全战略意义的不断扩大，以及我国经济的快速发展，加入世界贸易组织，与国际标准接轨，必须制定相应的检测标准进行安全控制。

现状：我国是农业大国，农产品种植区分布广泛，粮食收购多集中在县以下单位的粮食收储库点。

时间短，收购量大，存在很多隐患。

主要集中在以下方面：一方面粮食入库时间短，不宜长时间露天存放，因此对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测需要快速定性。

另一方面收购企业技术力量和硬件设备不足，利用大型仪器检测收购粮真菌毒素无法普及。

因此目前在粮食收购环节最需要解的问题就是建立高效、快速、低成本的定性检测方法。

该标准的制定有利于促进产业升级和产品结构的调整、推动技术进步和技术创新、推进与国际惯例接轨；有利于粮食质量标准体系的建立；有利于公共食品安全。

9.参考的国际标准
无
10.与有关的现行法律、法规和强制性标准的关系
11.关于强制性条款
12.贯彻国家标准的要求和措施建议
1）首先应在实施前保证文本的充足供应，让每个使用者都能及时得到文本。

这是保证新标准贯彻实施的基础。

2）发布后、实施前应将信息在媒体上广为宣传。

3）本次修订，不仅与生产厂家有关，而且与消费者有关。

对于使用过程中容易出现的疑问，要在媒体上撰文事先予以解释。

4）要分别标准的不同使用对象，消费者、生产厂家、质量监管部门等，有侧重点地进行培训、宣传。

5）实施的过渡期宜定为6个月。

6）建议质量监督部门加强监测。

13.废止现行有关标准的建议
无。