第五章氨基酸、蛋白质提取工艺特性

②成盐分离法:利用某些酸性氨基酸与某些金属 化合物，如氢氧化钡、氢氧化钙生成难溶性盐， 或某碱性氨基酸与一般酸生 成盐，从而与其他 未成盐的氨基酸分离。如南瓜子中的南瓜子氨基 酸是通过与过氯酸生成结晶性盐而分出的。 ③晶析法:利用不同氨基酸等电点不同，进行晶 析结晶分离。例如在含有亮氨酸、异亮氨酸和缬 氨酸的溶液，其pH值为1.5～2.0时，浓缩先晶析 出亮氨酸，它的母液加盐酸后再浓缩晶析出异亮 氨酸，最后母液中回收缬氨酸。

三、氨基酸的分离

水浸出液或稀乙醇减压浓缩后的水溶液往往含有 几种或十几种氨基酸，因此所得的是总氨基酸， 必须进行分离纯化。一般采用以下的纯化方法： ①离子交换法:这是分离氨基酸的常用方法。可 直接将水或稀乙醇提取物通过装有离子交换树脂 的交换柱，带正荷的氨基酸与树脂上的-SO３基 吸附。由于氨基酸带的正电荷随溶液pH发生变 化，同一氨基酸在不同pH的缓冲溶液中，以及 不同氨基酸在同一pH的环境中，所带的正电荷 各不相同，与磺酸基吸附的强弱也相应不同。可 以借助这种差别，使氨基酸互相分离。


用去垢剂分离膜蛋白时，选择去垢剂首先考虑： ①去垢剂的溶解能力；②去垢剂的温和性。强离 子型去垢剂（如SDS)一般具有很好的溶解能力， 但温和情况不理想，容易引起蛋白质变性。弱离 子型或非离子型去垢剂对蛋白质变性影响较小， 而溶解能力差。去垢剂的溶解能力与溶液的离子 强度大小有关。一般来说，离子强度增加，去垢 剂的溶解能力也随之增大。所以使用去垢剂溶解 膜蛋白时，须考虑各种条件。根据Klingenberg等 的经验，分离线粒体膜DP/ATP载体蛋白，选用 Triton X100比用Lubrol, Brij和Aminoxide等去垢 剂效果更好，所得ADP/ATP载体蛋白具有较高的 天然活性。但主要缺点是riton X100在280nm处有 强的紫外吸收，干扰用紫外法测定蛋白质的含量。

1.水溶液提取 凡能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱的 蛋白质或酶，一般都可用稀盐溶液或缓冲溶液进行 提取。稀盐溶液有利于稳定蛋白质结构和增加蛋白 质溶解度。加入的提取液的量要适当，加入量太少 提取不完全，加的量太多，则不利于浓缩，一般用 量为原材料3～6倍体积左右，可一次提取或分次提 取。提取时常缓慢搅拌，以提高提取效率。以盐溶 液或缓冲液提取蛋白质和酶时，常综合考虑下列因 素：
5.根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质。
主要手段是亲和层析法，即利用蛋白质分子能与 其相应的配体进行特异性的、非共价键的可逆性结合
而达到纯化的目的。
固相化金属亲和层析IMAC是新发展的一种亲和层
析技术。蛋白质分子中的咪唑基和巯基可与一些金属
元素（如Cu2+,Zn2+)形成配位结合，使蛋白质得到分


2.有机溶剂提取

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多 的蛋白质和酶，难溶于水、稀盐、稀酸和稀碱，常 用有机溶剂提取。如丙酮、异丙醇、乙醇、正丁醇 等，均可溶于水或部分溶于水，这些溶剂都同时有 亲脂性和亲水性。其中正丁醇有较强的亲脂性，也 有一定亲水性，在0℃时于水中有10.5％的溶解度。 它在水和脂分子间起着类似去污剂的作用，取代蛋 白质与脂质重新与蛋白质结合，使原来蛋白质在水 中溶解度大大增加。丁醇在水溶液及各种生物材料 中解离脂蛋白的能力极强，是其他有机溶剂所不及 的。我国生化工作者曾用此法成功地提取了琉拍酸 脱氢酶，对于碱性磷酸醋酶的提取效果也十分显著。

(5)去垢剂处理 去垢剂处理是目前广泛应 用于提取膜上水溶性蛋白和脂蛋白的方法，常 用的去垢剂有弱离子去垢剂脱氧胆酸盐、胆酸 盐，强离子型去垢剂十二烷基磺酸钠(SDS）和 非离子型去垢剂Triton X-100和Tween, Lubrol 和Brij等。
去垢剂处理膜蛋白时的浓度通常为1％左右，用 此法提取的膜蛋白和酶有细胞色素BS、胆碱醋 酶、细胞色素氧化酶、DPNH氧化酶、ADP/ATP载 体蛋白等。

第二节 蛋白质提取工艺特性

蛋白质按其功能可分为活性蛋白和非活性蛋白 二类；


按结构又可分为简单蛋白和结合蛋白二类：
再一种分类是根据蛋白质的溶解度差别而分为 水溶性蛋白、醇溶性蛋白等，还有一类硬蛋白， 不溶于水、稀酸、稀碱和有机溶剂，遇强酸、 强碱水解。
表6-1 不同结构的蛋白质及其溶解性质 蛋白质类别

有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又 能溶于一定比例的有机溶剂。在这样的 情况下，采用稀的有机溶剂提取常常是 为防止水解酶的破坏，并兼有除杂和提 高纯化效果的作用。
3、从细胞膜上提取水溶性蛋白质的方法

膜上的蛋白质或酶一般有两种存在状态，一是在 膜表面上，与膜成分联系比较松；第二是膜的内 在成分之一，或与膜成分结合较紧。蛋白质与膜 成分的结合可通过脂质形成复合物，也可以通过 金属离子与膜成分结合，或与膜其他蛋白质形成 复合物。与膜成分结合较松的蛋白质或酶，经过 充分破碎细胞，在一定pH范围用稀盐溶液即可提 取分离。但一些与膜成分结合较牢或属于膜组成 的蛋白质，提取则比较困难，须用超声波、去污 剂或其他比较强烈的化学处理，才能从膜上分离 出来。主要方法有：
7.根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白 质 逆流分配色谱

氨基酸在适当的条件下，能进行有机胺或有机酸的 几乎全部反应。与一般的酸和碱可生成稳定的盐， 大部分均能溶于水，但与重金属如铜、银、汞等制 成的络合物不溶于水，也可利用这种性质来分离氨
基酸。
二、氨基酸的浸出

①水浸出法：将中草药以粉碎机粉碎，装入 逆流浸出罐组的每一个浸出罐中。用水做浸 出溶剂，最好在有搅拌的条件下，加热进行 ②稀乙醇浸出法：将生药粉末装入逆流渗滤 浸出罐组的每一个浸出罐中。以70%乙醇进 行渗滤浸出，先浸出的溶液浓度较大，后浸 出的溶液浓度较低。最好采用逆流渗漉浸出 法，把出液系数控制在5，可以得到较好的浸 出效果。

(4）有机溶剂抽提 使用乙醇、吡啶、叔戊醇、正
丁醇等溶剂抽提及用冷丙酮做成丙酮粉，是提取
膜上与脂质结合的脂蛋白或膜内脂蛋白组分最常
用也较有效的方法，其中叔戊醇及正丁醇用于膜 内脂蛋白效果尤佳。前已提到正丁醇可在广泛的 pH (pH3-10)和温度范围（-2—40℃）内使用。用 有机溶剂结合其他方法已成功地提取了多种膜上 蛋白质和酶，如NPDH脱氢酶、唬珀酸脱氢酶、 细胞色素氧化酶、碱性磷酸酯酶、胆碱酯酶等。

(6)加人脂酶或磷酸酯酶水解蛋白质一脂 质复合物 从蛇毒中提取的磷酸醋酶A 主要作用于磷脂，最适pH为6^-8。从胰脏 中提取的醋酶作用于单、二、三甘油醋， 酶作用最适pH为7-8o醋酶和磷酸醋酶均需 要Ca 2＋激活。用酶法处理提取的膜蛋白 及酶有细胞色素C、 a-磷酸甘油脱氢酶、 TPNH-细胞色素C还原酶等。
三、蛋白质的纯化方法

1.根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质
蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质，在一 定pH环境中，某一种蛋白质解离成正、负离子的趋 势相等，或解离成两性离子，其净电荷为零，此时 环境的pH值即为该蛋白质的等电点。在等电点时蛋 白质性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、 粘度、渗透压等皆最小，因此可以利用蛋白质等电 点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。
离纯化。
6.根据蛋白质wk.baidu.com水基团与相应的载体基团结合来纯 化蛋白质
蛋白质上有疏水区，它们主要由酪氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极 性的侧链密集在一起，并暴露于分子表面。这 些疏水区能够与吸附剂上的疏水性基团结合， 在通过降低介质的离子强度和极性等方法将蛋 白质洗脱下来。如疏水相互作用层析
第五章 氨基酸和蛋白质提取工艺特性
第二节
氨基酸提取工艺特性
一、氨基酸的特性

因氨基酸分子较小，且有羧基、氨基，同时具有碱 性和酸性极性基团较多，所以它的极性较大，能溶 于水，不溶于有机溶剂。因同时具有羧基和氨基， 有酸碱两性的性质，能与酸和碱形成不同的盐。当 溶液的pH发生变化时，溶液中的离子状态也发生了 变化。在电场中酸性溶液的氨基酸则向阴极电泳， 而在碱性溶液中则向阳极电泳，当溶液的pH值达一 定时，氨基酸不向任何电极移动，此时溶液的pH值 就是该氨基酸的等电点。不同的氨基酸有不同的等 电点，在等电点时氨基酸的溶解度最低，根据这种 性质可以用电泳法分离氨基酸。
简单蛋白质 1.白蛋白 2.球蛋白 a.真球蛋白 b.拟球蛋白 3.醇溶蛋白 4.谷蛋白 5.精蛋白 6.组蛋白
溶
解
性
质
1、溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和 度硫酸铵析出。2、a.一般在等电点不溶于水，但加 入少量的盐、碱则可溶解。 b.溶于水，可为50%的饱和度硫酸铵析出。 3、溶于70—80%乙醇中，但不溶于水及无水乙醇。 4、在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀 酸，稀 碱溶液。 5、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。 6、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。 不溶于水、盐、稀酸、稀碱



四、氨基酸、肽的鉴别反应
①茚三酮(Ninhydrin)反应：所有的a-氨基酸及含 有a-氨基酸的肽类和蛋白质都能和该试剂反应呈 现兰色或兰紫色。必要时加热，反应可在滤纸上 进行。
(2)吲哚醌(Isatin）试剂反应：不同的氨基酸与吲 哚醌试剂反应，能显示不同的颜色。由于试剂的 配制方法不同，对同一种氨基酸所显示的颜色也 往往有差异。吲哚醌不仅可用于氨基酸的显色， 而且从其颜色的区别，可以帮助辨认氨基酸。显 色不稳是其特点，氨对显色无干扰。

(1)盐浓度：提取蛋白质的盐的浓度，一般 在0.02～0.2M的范围内。常用稀溶液和缓 冲液有0.02～0.05M磷酸缓冲液，0.09～ 0.15M氯化钠溶液。 (2)pH值：蛋白质和酶所用的提取液pH值 一般选择在被提取的蛋白质等电点两侧的 稳定区内。 (3)温度：蛋白质和酶一般都不耐热，所以 提取时通常要求低温操作。



(1)浓盐或尿素等溶液提取 如NaClO4、尿素、肌 盐酸等溶液均有人应用于提取膜蛋白，当以上溶液 浓度达到2mol/L时，可提取27％以上的膜蛋白， 但使用这样条件易引起蛋白质和酶的变性。 (2)碱溶液提取 碱性条件也可以解离与膜上成 分结合的蛋白质。在pH8-10范围内，某些膜蛋白 随着pH的提高而溶解度大大增加，至pHll时，有 40%-50％的膜蛋白被抽出，但碱提取法也容易引 起蛋白质和酶的失活，应用上不广。 (3)加人金属鳌合剂 蛋白质通过金属离子与膜 成分结合时，加人金属鳌合剂如EDTA可使蛋白质释 放出来。用此法曾成功地提取了膜上ATP酶的偶联 因子I 。EDTA与超声波联合处理抽提膜上的磷酰 转移酶效果更好。
硬蛋白质
( 包括磷蛋白、粘 蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、 血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白 等)
此类蛋白质溶解度性质随蛋白质与非蛋白结合部分 的不同而异， 除脂蛋白外，一般可溶于稀酸，稀碱 及盐溶液中，脂蛋白如脂质部分露于外，则脂溶性 占优势，如脂质部分被包围于分子之中，则水溶性 占优势。
二、蛋白质及酶的一般提取方法
等电点沉淀
等电点除杂
2.根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化 蛋白质 蛋白质的一个主要特点是：分子大， 而且不同种类的蛋白质分子大小也不相等。 由此可以用凝胶过滤法、超滤法、离心法 及透析法等将蛋白质与其它小分子物质分 离，也可将大小不同的蛋白质分离。 凝胶过滤层析
3.根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质 蛋白质的溶解度受溶液的pH、离子强度、溶剂 的电解质性质及温度等多种因素的影响。在同一特 定条件下，不同的蛋白质有不同的溶解度，达到分 离的目的。盐溶与盐析，结晶，低温有机溶剂沉淀 法。如:盐析和有机溶剂分级分离法。 4.根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质 离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子 或负离子基团，它对溶液中不同的带电物质呈现不 同的亲和力，从而使这些物质分离提纯。 蛋白质、 多肽或氨基酸具有能够离子化的基团。 对蛋白质的离子交换层析，一般多用离子交换 纤维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝 胶为骨架的离子交换剂。主要是取得其有较大的蛋 白质吸附容量、较高的流速和分辨力。