病毒学检验实验指导

病毒学实验考试备考指导
编者：程家国（大理大学）指导教师：吴利先
鸡胚接种
原理
鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。

鸡胚的结构与功能:
鸡胚由三个胚层发育而来，即外胚层，中胚层、内胚层，它们构成了胚胎的组织与器官 卵壳:上有细孔，进行气体交换
壳膜:使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。

气室:呼吸和调节压力
绒毛尿囊膜:起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。

尿囊腔:胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。

羊膜与羊膜腔:其中盛有羊水，胎体浸泡于其中
卵黄:在胚胎发育早期供给鸡胚营养
卵白:在胚胎发育晚期供给鸡胚营养
受精卵的选择:最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响
受精卵的壳最好是白色的
受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。

孵育:孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃
相对湿度：50%-60%
必须保证有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后
从孵育后第3天开始，每天翻卵一次。

检卵:自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。

孵育4-5日于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。

未受精卵：只见模糊的卵黄阴影，不见血管和鸡胚痕迹
活胚：具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可见到胚动，但孵育14、15天以后胚动不明显，甚至无胚动。

死胚：血管昏暗模糊，没有胚动。

接种前处理:用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅笔画出气室和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。

对鸡胚进行消毒。

鸡胚用于病毒培养的优缺点
（一）优点:组织分化程度低，病毒易于增殖；可选择不同的日龄和接种途径；感染病毒的组织和液体中含大量病毒；容易采集和处理；来源充足；设备和操作简便易行
（二）缺点:胚内可能污染细菌和病毒；母源抗体；许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针。

接种方法途径：
1）卵黄囊接种法（6-8日龄鸡胚）：主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。

2）绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚）：主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖
3）羊膜腔接种：该途径主要用于临床材料（如患者的鼻洗液及咽漱液）的病毒分离。

4）尿囊腔接种（10-11日龄的鸡胚）：主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感病毒、新城疫病毒的分离和增殖
收毒：收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以上，冻死胚胎，防止出血。

根据接种途径的不同，收获相应的材料
1、绒毛尿囊膜接种收获接种部位绒毛尿囊膜
2、尿囊腔接种收获尿囊液（5-8ml）
3、卵黄囊接种收获卵黄囊或胚体
4、羊膜腔接种收获羊水（0.5-1ml）
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
实验原理：
血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。

①用以测定病毒的含量②计算病毒的血凝价，为血凝抑制试验做准备
一个血凝单位：以50%的红细胞发生凝集的病毒悬液的最高稀释度作为该病毒液的红细胞凝聚效价。

血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。

这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。

①用于检测血清中抗体含量②鉴定病毒的型、亚型；
以出现＋＋（50％凝集）的抗原最高稀释倍数为该抗原的血凝价
以出现完全抑制凝集(即不凝集) 的血清最高稀释倍数为该血清的血凝抑制价微生物基因组DNA的提取
❑DNA提取的几种方法>非基因组DNA的提取：
•1）质粒DNA的提取：碱裂解法、煮沸法
•2）线粒体、叶绿体DNA的提取：差速离心结合SDS裂解法
❑根据细胞裂解方式的不同有：
物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法
化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法
生物方式：酶法
质粒DNA－碱裂解法：
碱裂解法原理：染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，
而质粒DNA为共价闭合环状分子；
当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。

DNA提取的基本步骤：
I.材料准备
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
III.核酸分离、纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
核酸制备的一般原则:
●分离纯化核酸总的原则：
①应保证核酸一级结构的完整性；
②排除其它分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、外源DNA、RNA等）。

●核酸纯化应达到的要求：
①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；
②其它生物大分子的污染应降低到最低程度；
③排除其它核酸分子的污染。

核酸制备时应注意的事项::
①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。

②减少化学因素对核酸的降解（如过量酸碱）
③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力（强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融）高温
④防止核酸的生物降解（核酸酶的预防）
核酸制备的步骤:破碎细胞>提取>纯化
核酸制备实验原理：制备基因组DNA，必须破碎细胞膜，去除蛋白质、脂类和糖类等生物大分子且避免被细胞内核酸酶降解即保证DNA的完整性
•浓度计算：OD260＝1时：
dsDNA(双链DNA)浓度约为50 μg/mL
ssDNA(单链DNA)浓度约为37μg/ml
RNA浓度约为40μg/ml
寡核苷酸浓度约为30μg/ml
dsDNA浓度（μg/μL）=OD260×稀释倍数×50 /1000
RNA 浓度（μg/μL）=OD260×稀释倍数×40 /1000
琼脂糖凝胶电泳法-----分离鉴定核酸的常规方法
纯度的检测：DNA纯品的OD260/OD280约为1.8。

OD260/OD280＞1.9说明含有RNA污染；
OD260/OD280＜1.6 说明有残余的蛋白质、酚等存在。

OD230/OD260的比值应在0.4~0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。

有些分光光度计则显示OD260/OD230，其比值应在2~2.5之间，偏小则说明有残余盐剩余。

琼脂糖凝胶制备及电泳：凝胶制备》倒胶》点样》电泳》紫外灯下观察
微生物基因组DNA提取的应用：1)构建基因组文库2)southern杂交3)PCR技术
噬菌体Bacteriophage / phage
噬菌体：感染细菌、真菌、放线菌和螺旋体等微生物的病毒，只能在活的宿主菌内复制增殖噬菌体遗传物质可在其感染的宿主菌之间和宿主菌与噬菌体间传递，且赋予宿主菌某些性状具有病毒的特性
特点：个体微小，可通过滤菌器，无细胞结构，具有严格的细胞内寄生性，分布广泛宿主特异性：流行病调查；分型
参与细菌变异：转导, 溶原性转换
形态、结构：基本形态有：蝌蚪形、微球形、细杆形。

大多数为蝌蚪形，由头部和尾部组成
• 化学组成：由蛋白质和核酸组成
• 抗原性：蛋白质部分具有抗原性
• 抵抗力：对理化因素的抵抗力比一般细菌繁殖体强
•分类：毒性噬菌体、温和噬菌体
噬菌体感染细菌有两个结果：
•噬菌体在宿主菌内增殖后使宿主菌裂解，释放的噬菌体再感染其他敏感细胞。

建立溶菌性周期。

－－毒性噬菌体
增殖过程为：•吸附• 穿入• 生物合成• 成熟和释放
•噬菌体感染细菌后不增殖，其核酸整合到细菌染色体上，随细菌染色体的复制而复制，并随细菌分裂而分配至子代细菌的染色体中，建立溶原性周期。

－－温和噬菌体
•前噬菌体（prophage）：整合在细菌基因组中的噬菌体基因组
•溶原性细菌（lysogenic bacterium）：带有前噬菌体的细菌
在液体培养基中，噬菌现象可使浑浊菌液变得澄清。

在固体培养基上，若用适量的噬菌体和宿主菌液混合后接种培养，培养基表面可有透亮的溶菌空斑出现。

一个空斑系由一个噬菌体复制增殖并裂解细菌后形成，称为噬斑(plaque),不同噬菌体噬斑的形态与大小不尽相同。

若将噬菌体按一定倍数稀释，通过噬斑计数，可测定一定体积内的噬斑形成单位(plaque forming units,pfu)数目，即噬菌体的数目。

温和噬菌体将本身的基因转给宿主菌的传递方式-------溶原性转换(lysogenic conversion)：
另有肉毒梭菌产生肉毒毒素，化脓性链球菌产生红疹毒素；沙门菌、志贺菌等的抗原结构和血清型改变亦受温和噬菌体控制。

以噬菌体为传递工具将供体菌基因传递给受体菌的过程------转导(transduction)
噬菌体是发酵工业的大敌
噬菌体的应用：细菌的分型与鉴定•细菌感染的诊断与治疗•分子生物学研究的工具。