木瓜蛋白酶的分离纯化_关于食品生物化学综合设计性实验的构思_李妍

第２７卷第５期肇庆学院学报Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．５

２００６年１０月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＺＨＡＯＱＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

Ｏｃｔ．２００６收稿日期：２００５－１２－２９

作者简介：李妍（１９７８－），女，黑龙江肇东人，肇庆学院轻工化学系副教授，博士．

木瓜蛋白酶的分离纯化

———关于食品生物化学综合设计性实验的构思

李妍，黄志明

（肇庆学院轻工化学系，广东肇庆５２６０６１）

食品生物化学是食品专业本科学生的一门专业基础课，为了将这门课的理论教学与实际应用结合起来，需要开设大量的实验课．目前已开设的实验多为基础验证性实验，为了强化学生分析和解决问题的能力，有必要在该课程实验中增加综合设计性实验．

木瓜蛋白酶是一类巯基蛋白酶，广泛地存在于番木瓜（Ｃａｒｉｅａｐａｐａｙａ）的茎叶和果实中，未成熟的乳汁中含量最高．因其含量高、稳定性好、蛋白水解能力强，对多种蛋白质均具有很好的降解作用，目前已被广泛应用于各个行业［１］．在食品中，木瓜蛋白酶被用于肉类嫩化、啤酒澄清和鱼类加工等工艺中．由于此酶为纯天然产物，其开发前景广阔．在本科实验中引入这一综合设计性实验，可以使学生通过实验熟悉酶和蛋白质的提取与纯化方法，掌握相关的实验技能和实验手段，加深对理论知识的理解和学习．

１

综合设计性实验的内容１．１木瓜蛋白酶粗酶的分离制备

实验以未成熟的木瓜为原料．木瓜蛋白酶是一种胞外酶，能分泌到乳汁中，可直接将木瓜乳汁进行低温真空干燥，再经粉碎就可以得到木瓜蛋白酶的粗品．为了避免干燥过程中木瓜蛋白酶失活，可在木瓜乳汁中加入适量的保护剂，保护木瓜蛋白酶中的活性巯基，常用的保护剂有ＥＤＴＡ、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠等．本实验的关键是选择适宜的保护剂．教师可指导学生通过查阅文献，对保护剂的种类和使用量进行筛选，以保证良好的分离效果．实验可以粗酶的提取率和酶的比活力作为评价指标．

１．２粗酶的纯化

粗酶中除了含有木瓜蛋白酶外，还含有其他的蛋白质和小分子物质，需要通过盐析等方法对其进一步纯化．对于木瓜蛋白酶纯化的研究报道也较多，乙引等［２］对木瓜乳汁进行真空干燥，用（ＮＨ４）２Ｓ０４沉淀方法分别得到了木瓜蛋白酶的粗品和精品．本实验选择饱和硫酸铵盐析法纯化木瓜蛋白酶，纯化期间仍要注意对酶活性的保护．

盐析是目前常用的蛋白质分离技术，采用这种方法进行酶的纯化，不仅可将酶与蛋白质联系起来，而且可以使学生掌握蛋白质分离常用方法的原理和操作步骤．盐析是通过中和蛋白质表面的电荷和破坏蛋白质的水化层实现分离，实验的关键是饱和硫酸铵添加浓度的确定．学生不仅要通过查阅资料确定实验条件，还要了解分离原理，以便对实验进行充分的准备．在此基础上，学生还要学

摘要：针对食品生物化学课的实际情况，提出了开设综合设计性实验的思路，初步给出了木瓜蛋白

酶分离纯化实验的内容，旨在为今后的实验提供理论指导．关键词：食品生物化学；综合设计性实验；

酶的分离纯化中图分类号：Ｇ６４２

文献标志码：Ａ文章编号：１００９－８４４５（２００６）０５－００３６－０３

第５期李妍等：木瓜蛋白酶的分离纯化

３７会积极思考，注意实验操作过程中的问题和细节，以逐渐增强科研意识及解决问题的能力．

１．３木瓜蛋白酶性质的测定

得到纯化酶后，需要对其性质进行测定．首先，通过蛋白质的凝胶电泳测定蛋白质的分子量分布，电泳是基于蛋白质的两性解离和等电点的性质加以分离的方法．实验中应用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳，对上述不同分离阶段的酶样均进行测定，比较纯化的效果．根据实验中应用的已知分子量的蛋白质和木瓜蛋白酶对照样，可以推算分离得到的木瓜蛋白酶的分子量情况．在实验过程中，需要学生配制电泳用分离胶和浓缩胶，要灌胶、操作电泳仪，并进行胶的染色和脱色．由此加深学生对电泳原理、电泳仪操作原理和方法的了解，掌握电泳法测定蛋白质分子量的一般操作步骤，发现并解决实验过程中出现的问题．根据实验不同分离阶段所得样品的电泳带，学生可以直观地看到酶纯化的情况．

木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶，本实验中要对木瓜蛋白酶的自由巯基进行测定，我们采用ＤＴＮＢ（硝基苯甲酸二硫化合物），反应后测定产物在４１２ｎｍ的吸光度．这是测定半胱氨酸巯基的常用方法．

１．４蛋白质浓度和木瓜蛋白酶酶活力的测定方法

蛋白质浓度可以采用Ｆｏｌｉｎ－酚比色法、考马斯亮蓝比色法和双缩脲比色法进行测定，相比而言，双缩脲比色法的灵敏度要低于前２种方法．本实验选用考马斯亮蓝比色法进行蛋白质含量的测定，显色后测定波长为５９５ｎｍ．此方法不受酚类、游离氨基酸和小分子肽的影响，在０．０１～１．０ｇ6Ｌ蛋白质含量范围内均可使用．木瓜蛋白酶活力的测定采用酪蛋白为底物，加入酶的保护剂，用Ｆｏｌｉｎ－酚试剂显色，测定６８０ｎｍ波长下的吸光度后计算得到酶活力．酶的比活力是指酶总活力与蛋白质含量的比值．

蛋白质和酶是食品生物化学课中２项重要的内容．通过这部分实验，不仅可以使学生熟悉测定蛋白质浓度和酶活力的方法，而且可以将实验现象与课本的理论知识结合起来，提高学生学习的积极性和效率．

２开设综合设计性实验的意义

综合设计性实验是将基础理论知识与多种实验技能和方法归纳、分析并相互渗透的一种有效的实验形式．它在一定程度上弥补了传统实验的缺陷，具体说来，它有以下特点：实验技能的综合性、实验操作的独立性和实验过程的可思考性［３］．开设综合性实验的意义有如下５点．１）增加理论教学与实践的联系，培养学生应用知识的能力．综合性实验的开设，既可使学生将理论知识通过实验与应用过程结合起来，还可使他们将本来分散的知识块联系起来，将各部分的学习通过实验有效地融合在一起，从而强化他们对这门课的整体认识和应用能力．木瓜蛋白酶的分离纯化实验就综合了多方面知识，包括蛋白质含量测定、分离纯化方法和酶活力测定等内容，而且涉及的理论均为本课程的重点知识，这有利于激发学生对理论知识学习的兴趣，从而达到更好的学习和应用效果．

２）多种实验过程综合，增强了学生的综合实验操作技能．传统实验多针对某一部分的知识进行实验应用，而综合设计性实验是将多个部分的知识有机地串联起来，给予学生综合实验技能的训练．开设上述实验，既能有效利用实验室的现有资源，还能将多个实验结合起来训练学生的综合技能，有利于提高学生的综合素质．

３）学生独立设计完成实验，增强了学生的科学研究意识．通过实验，学生开始能够灵活运用所学知识分析和解决实际问题，同时提高了他们通过查阅资料获取信息的能力，培养了学生独立、认真、严谨的科研和工作态度．在上述实验中，学生需要通过查阅资料选择实验参数，设计实验方案，还要独立开展物质的制备及性质分析．这使学生了解了科学研究的一般程序，提高了对科学研究的