分子生物学：真核生物表达系统
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2013年7月27日星期六 36
(1)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus,RSV)，在病毒颗粒内含有四条 RNA分子，较大的两条为反转录病毒 基因组，它编码病毒的全部遗传信息， 另外两条小的RNA分子为寄主细胞的 tRNATrp。
2013年7月27日星期六
37
(2)、pLNCX：由Clontech公司构建 的，含有Moloney小鼠白血病病毒和 Moloney小鼠肉瘤病毒的一些元件及 来自pBR322的一些元件组成。
逆 转 录 病 毒 载 体 稳 定 、 长 期 表 达 外 源 基 因41
2、腺病毒载体：人腺病毒包括六 个亚属，目前用来构建基因表达载 体的腺病毒主要是C亚属的2型病毒 和5型病毒。为双链线性DNA，在 双链DNA的两端各有一个反向重复 序列LTR，
2013年7月27日星期六
42
2013年7月27日星期六
糖基化 分泌 折叠 磷酸化 酰基化 酰胺化
2013年7月27日星期六
酵母细胞 0~10%
＋/－ ＋ ＋ ＋/－ ＋ ＋ －
昆虫细胞 0～30%
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
哺乳动物细胞 0~1%
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
4
0~60% ＋/－
－ ＋/－ ＋/－ － － －
二、真核细胞表达外源基因的意义 研究基因表达产物的功能 生产有生物活性的蛋白质
44
4、人疱疹病毒(EBV)衍生载体：EB 病毒可以将休止状态的人B淋巴细胞 转化为能在培养基条件下无限增殖的 分裂母细胞。以EB病毒DNA为基础构 建的表达载体可在范围广泛的哺乳动 物细胞中低水平或中等水平表达外源 基因，对允许插入的外源基因片段的 大小没有严格的限制。
2013年7月27日星期六
1、将目的基因导入各种细胞中，观察 表达产物对细胞活动的影响从而推论其 功能特征
2、通过突变研究基因表达产物功能区 及关键位点 3、制备过量表达产物用于结构分析
2013年7月27日星期六 5
外源基因导入真核细胞的基本方法 DEAE葡聚糖法 磷酸钙共沉淀法 脂质体介导法 醋酸锂法 电穿孔法 显微注射法
23
常用的哺乳动物表达质粒载体 1、pcDNA3.1：由Invitrogen公司提 供的目前应用最多的真核质粒表达 载体之一。其主要特征包括： 1)有高效表达的CMV启动子 2)有多克隆位点 3)有牛生长激素多腺苷酸化信号
2013年7月27日星期六
24
2013年7月27日星期六
25
pSI：该质粒出自Promega公司，含 SV40增强子区，在其下游还有珠蛋 白/IgG嵌合内含子，可进一步增强表 达。多腺苷酸化信号为晚期SV40多 腺苷酸化信号。可用于瞬时转染和 稳定转染。该载体本身不含选择标 记，若用于稳定转染，必须与含选 择标记基因的表达载体一起进行共 转染。
2013年7月27日星期六 11
实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活 因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人 DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时， 产生错折叠和非糖基化，而在酵母 中表达tPA产生过糖基化，二者的产 物都没有生物活性。
2013年7月27日星期六
12
分泌型哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外 源重组蛋白直接分泌到培养基中。这个重组表达 单位包括N末端的信号肽，其作用是起始新生肽 链插入到内质网中，此信号肽在分泌过程中被切 除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。从内质 网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖 基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程也 使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。
（一）质粒型载体：通过对细菌质粒改造 获得。一般为在原质粒的基础上，插入了 一些病毒或其它一些物种及人的基因表达 调控序列。 1、哺乳动物细胞质粒表达载体的结构 典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺 式作用元件：
2013年7月27日星期六 16
（1）启动子
常用的启动子种类及其各自的强度 启动子 EF －1 CMV RSV SV40 later SV40 early Adeno major late β－globin 来 源 强 度
2013年7月27日星期六 26
2013年7月27日星期六
27
pCMV-HA：为Clontech公司产品， 该质粒载体含CMV启动子，在CMV 下游的内含子为晚期SV40 19S mRNA内含子及SV40 16S mRNA内 含子，在N端有血凝素(HA)表位标签 和氨基苄青霉素抗性基因选择标记。
2013年7月27日星期六 6
病毒感染 转染
化学法
物理法
三、外源基因在真核细胞中表达的主 要方式 1、瞬时表达：转染的DNA未与宿主 染色体整合，不能随宿主基因组的复 制而扩增，只能在细胞内维持2~3天 2、稳定表达：转染的DNA与宿主染 色体整合，能随宿主基因组的复制转 录和翻译，并被稳定遗传。
2013年7月27日星期六
10
哺乳动物细胞表达体系的优点
• 哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经 发展很快。
• 哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不 能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后 加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分 泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物 细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的 蛋白质。
2013年7月27日星期六
7
五、外源基因在真核细胞中表达产物 的鉴定和纯化 mRNA的鉴定 蛋白产物鉴定 mRNA的鉴定：印迹杂交或反转录PCR 蛋白产物鉴定：免疫印迹或电泳 提取方法有：沉淀法、电泳法、层析法 等
2013年7月27日星期六 8
哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞 表达系统是生产天然蛋白 的理想表达系统，是目前应用最广泛的 动 物细胞 表达系统。其优点和缺点都极其显 著。产物的 抗原性、免疫原性和功能 与 天 然蛋白质 最接近，糖基化等后加工最精确。 一般会产生正确加工的、有活性的蛋白。
2013年7月27日星期六
18
哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区 BGH 来 源 效 3 率
牛生长激素
SV40 late
TK SV40 early
猿猴病毒40晚期基因
单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
2
1.5 1
Hep B
乙肝表面抗原
1
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19
（3）选择标记 1)药物选择标记基因 a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉 素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。 转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
人延长因子1基因 人巨细胞病毒立早基因 劳斯肉瘤病毒LTR 猿猴病毒40晚期基因 猿猴病毒40早期基因 腺病毒主要晚期启动子 小鼠β－珠蛋白基因
40～160 4 2 1.1 1 0.4 0.2
2013年7月27日星期六
17
（2）多聚腺苷酸化信号（加尾信号）：所 有真核细胞mRNA3ˊ末端都具有Poly(A)结 构，多腺苷酸化信号一般由位于多腺苷酸化 位点上游11～30核苷酸的保守序列AAUAAA 和一个下游的GU或U富含区组成，
34
二、病毒型载体 1、逆转录病毒载体：为RNA病毒， 进入处于增殖状态的细胞后，在细 胞分裂过程中反转录成DNA并整合 入宿主基因组而进行稳定表达。整 合位点随机，在基因组内的整合可 能破坏一些重要的基因位点
2013年7月27日星期六
35
二、病毒型载体
• 逆转录病毒是RNA病毒，RNA基因组转变 成DNA，能有效地整合到宿主基因组中，长 久地在宿主基因组中寄宿，并在每次细胞分 裂时，随宿主DNA一起复制。 • 整合的原病毒依靠基因组末端的强启动子 (长末端重复LTR序列）稳定地产生病毒RNA。 此病毒RNA既产生病毒蛋白质的mRNA，又 产生新病毒的基因组RNA。
45
猴多瘤病毒DNA（SV40）
SV40的基因组DNA
t / T基因编码病毒的小抗原和大 抗原与病毒的致癌作用密切相关 SV40在裂解宿主细胞前的晚期状 态时，每个宿主细胞含有105个病毒 DNA拷贝，因此十分适合用于高效表 达外源蛋白
1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、表达出来的蛋白质不能有效、正 确的折叠及二硫键配对错误 3、缺乏信号肽切除、糖基化、磷酸 化和羧化等翻译后修饰以及对原核 细胞有毒性。
2013年7月27日星期六 3
一、真核细胞表达宿主的种类及优势
不同表达系统蛋白质表达及翻译后修饰情况的比较 大肠杆菌 产率 蛋白酶消化
43
3、牛乳头瘤病毒(BPV)病毒基因组 为双链DNA，全长7095kb。能在体 外转化啮齿动物细胞，转化受体细 胞后以染色体外DNA的形式存在， 细胞中病毒DNA的拷贝数一般可达 到20~100。以BPVDNA构建的表达 载体可以在多种哺乳动物细胞中低 水平或中等水平表达。
2013年7月27日星期六
2013年7月27日星期六
1
第一节 概述 在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质 往往只能在真核细胞表达系统中才 能获得有活性的表达产物。其原因 有：
2013年7月27日星期六 2
2013年7月27日星期六
30
2013年7月27日星期六
31
pTRE：与pTet-Off(或pTet-On)质粒 一起构成四环素或强力霉素诱导表达 载体系统多用于建立细胞毒性基因稳 定转染的细胞系，并研究该基因诱导 表达对细胞的影响
2013年7月27日星期六
32
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33
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2013年7月27日星期六 20
b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。 c、博来霉素抗性基因： d、HPH基因：该基因编码潮霉素B磷 酸转移酶
2013年7月27日星期六 21
2）报告基因： 氯霉素乙酰转移酶(CAT) 3）表位标签 常用的表位标签有GST(谷胱甘肽转移 酶)、人IgG1的Fc区、FLAG等
2013年7月27日星期六 13
分泌蛋白新生肽链N端的一段20～ 30氨基酸残基组成的肽段。将分泌 蛋白引导进入内质网，同时这个肽 段被切除。现这一概念已扩大到决 定新生肽链在细胞中的定位或决定 某些氨基酸残基修饰的一些肽段。
20Baidu Nhomakorabea3年7月27日星期六
14
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15
第二节外源基因在哺乳动物细胞中表达 一、哺乳动物细胞表达载体
2013年7月27日星期六
9
但该表达系统的 表达水平较低 、 培养基 昂贵、生长缓慢、含有过敏物质 等缺点在 实际应用过程中较难避免。哺乳动物细胞 表达系统通常用来生产用 常规方法无法获 得 的 真核细胞蛋白 。如EPO，TNF受体， 基因工程单抗等。 CHO（中国仓鼠卵巢）是目前重组糖蛋 白生产的首选体系。
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DNA U3 U3 R U5 R
SD Ψ gag pol
SA env U3 U3 PB(+) R U5 R
逆 病 毒 的 结 构 和 载 体 结 构
2013年7月27日星期六
PB(-) mRNA
5'
R U5
Ψ
gag
pol
env
U3
R
AAAA 3'
5'
R U5
+
env
U3
R
AAAA 3'
SD
SA
P
IRES
IRES--Internal Ribosome Entry Site
Ap
r
40
ori
原病毒DNA转 染进包装细胞 中，包装原病 毒产生将病毒 RNA包装成感 染性病毒粒子 的所有蛋白质 ，但却不能包 装自身的RNA
2013年7月27日星期六
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28
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29
pBudCE4.1：是Invitrogen公司的一 个双启动子（CMV和EF-1α）质粒 载体，在每个启动子下游都有多克 隆位点，用此质粒可同时实现两个 基因的独立表达。若用来制备稳定 表达的细胞株，该载体可以确保相 同拷贝数的基因被同时表达。
2013年7月27日星期六
22
(4)复制子：哺乳动物基因表达载体的 复制子一般采用病毒基因组的复制子， 由于某些病毒可以在哺乳动物宿主细胞 内进行自主复制。不同的病毒复制子的 工作效率不同，常用于构建哺乳动物表 达载体的复制子有SV40、多瘤病毒和牛 乳头瘤病毒等的复制子。
2013年7月27日星期六
(1)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus,RSV)，在病毒颗粒内含有四条 RNA分子，较大的两条为反转录病毒 基因组，它编码病毒的全部遗传信息， 另外两条小的RNA分子为寄主细胞的 tRNATrp。
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(2)、pLNCX：由Clontech公司构建 的，含有Moloney小鼠白血病病毒和 Moloney小鼠肉瘤病毒的一些元件及 来自pBR322的一些元件组成。
逆 转 录 病 毒 载 体 稳 定 、 长 期 表 达 外 源 基 因41
2、腺病毒载体：人腺病毒包括六 个亚属，目前用来构建基因表达载 体的腺病毒主要是C亚属的2型病毒 和5型病毒。为双链线性DNA，在 双链DNA的两端各有一个反向重复 序列LTR，
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糖基化 分泌 折叠 磷酸化 酰基化 酰胺化
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酵母细胞 0~10%
＋/－ ＋ ＋ ＋/－ ＋ ＋ －
昆虫细胞 0～30%
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
哺乳动物细胞 0~1%
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
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0~60% ＋/－
－ ＋/－ ＋/－ － － －
二、真核细胞表达外源基因的意义 研究基因表达产物的功能 生产有生物活性的蛋白质
44
4、人疱疹病毒(EBV)衍生载体：EB 病毒可以将休止状态的人B淋巴细胞 转化为能在培养基条件下无限增殖的 分裂母细胞。以EB病毒DNA为基础构 建的表达载体可在范围广泛的哺乳动 物细胞中低水平或中等水平表达外源 基因，对允许插入的外源基因片段的 大小没有严格的限制。
2013年7月27日星期六
1、将目的基因导入各种细胞中，观察 表达产物对细胞活动的影响从而推论其 功能特征
2、通过突变研究基因表达产物功能区 及关键位点 3、制备过量表达产物用于结构分析
2013年7月27日星期六 5
外源基因导入真核细胞的基本方法 DEAE葡聚糖法 磷酸钙共沉淀法 脂质体介导法 醋酸锂法 电穿孔法 显微注射法
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常用的哺乳动物表达质粒载体 1、pcDNA3.1：由Invitrogen公司提 供的目前应用最多的真核质粒表达 载体之一。其主要特征包括： 1)有高效表达的CMV启动子 2)有多克隆位点 3)有牛生长激素多腺苷酸化信号
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25
pSI：该质粒出自Promega公司，含 SV40增强子区，在其下游还有珠蛋 白/IgG嵌合内含子，可进一步增强表 达。多腺苷酸化信号为晚期SV40多 腺苷酸化信号。可用于瞬时转染和 稳定转染。该载体本身不含选择标 记，若用于稳定转染，必须与含选 择标记基因的表达载体一起进行共 转染。
2013年7月27日星期六 11
实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活 因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人 DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时， 产生错折叠和非糖基化，而在酵母 中表达tPA产生过糖基化，二者的产 物都没有生物活性。
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分泌型哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外 源重组蛋白直接分泌到培养基中。这个重组表达 单位包括N末端的信号肽，其作用是起始新生肽 链插入到内质网中，此信号肽在分泌过程中被切 除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。从内质 网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖 基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程也 使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。
（一）质粒型载体：通过对细菌质粒改造 获得。一般为在原质粒的基础上，插入了 一些病毒或其它一些物种及人的基因表达 调控序列。 1、哺乳动物细胞质粒表达载体的结构 典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺 式作用元件：
2013年7月27日星期六 16
（1）启动子
常用的启动子种类及其各自的强度 启动子 EF －1 CMV RSV SV40 later SV40 early Adeno major late β－globin 来 源 强 度
2013年7月27日星期六 26
2013年7月27日星期六
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pCMV-HA：为Clontech公司产品， 该质粒载体含CMV启动子，在CMV 下游的内含子为晚期SV40 19S mRNA内含子及SV40 16S mRNA内 含子，在N端有血凝素(HA)表位标签 和氨基苄青霉素抗性基因选择标记。
2013年7月27日星期六 6
病毒感染 转染
化学法
物理法
三、外源基因在真核细胞中表达的主 要方式 1、瞬时表达：转染的DNA未与宿主 染色体整合，不能随宿主基因组的复 制而扩增，只能在细胞内维持2~3天 2、稳定表达：转染的DNA与宿主染 色体整合，能随宿主基因组的复制转 录和翻译，并被稳定遗传。
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哺乳动物细胞表达体系的优点
• 哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经 发展很快。
• 哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不 能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后 加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分 泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物 细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的 蛋白质。
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五、外源基因在真核细胞中表达产物 的鉴定和纯化 mRNA的鉴定 蛋白产物鉴定 mRNA的鉴定：印迹杂交或反转录PCR 蛋白产物鉴定：免疫印迹或电泳 提取方法有：沉淀法、电泳法、层析法 等
2013年7月27日星期六 8
哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞 表达系统是生产天然蛋白 的理想表达系统，是目前应用最广泛的 动 物细胞 表达系统。其优点和缺点都极其显 著。产物的 抗原性、免疫原性和功能 与 天 然蛋白质 最接近，糖基化等后加工最精确。 一般会产生正确加工的、有活性的蛋白。
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哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区 BGH 来 源 效 3 率
牛生长激素
SV40 late
TK SV40 early
猿猴病毒40晚期基因
单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
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1.5 1
Hep B
乙肝表面抗原
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（3）选择标记 1)药物选择标记基因 a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉 素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。 转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
人延长因子1基因 人巨细胞病毒立早基因 劳斯肉瘤病毒LTR 猿猴病毒40晚期基因 猿猴病毒40早期基因 腺病毒主要晚期启动子 小鼠β－珠蛋白基因
40～160 4 2 1.1 1 0.4 0.2
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（2）多聚腺苷酸化信号（加尾信号）：所 有真核细胞mRNA3ˊ末端都具有Poly(A)结 构，多腺苷酸化信号一般由位于多腺苷酸化 位点上游11～30核苷酸的保守序列AAUAAA 和一个下游的GU或U富含区组成，
34
二、病毒型载体 1、逆转录病毒载体：为RNA病毒， 进入处于增殖状态的细胞后，在细 胞分裂过程中反转录成DNA并整合 入宿主基因组而进行稳定表达。整 合位点随机，在基因组内的整合可 能破坏一些重要的基因位点
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35
二、病毒型载体
• 逆转录病毒是RNA病毒，RNA基因组转变 成DNA，能有效地整合到宿主基因组中，长 久地在宿主基因组中寄宿，并在每次细胞分 裂时，随宿主DNA一起复制。 • 整合的原病毒依靠基因组末端的强启动子 (长末端重复LTR序列）稳定地产生病毒RNA。 此病毒RNA既产生病毒蛋白质的mRNA，又 产生新病毒的基因组RNA。
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猴多瘤病毒DNA（SV40）
SV40的基因组DNA
t / T基因编码病毒的小抗原和大 抗原与病毒的致癌作用密切相关 SV40在裂解宿主细胞前的晚期状 态时，每个宿主细胞含有105个病毒 DNA拷贝，因此十分适合用于高效表 达外源蛋白
1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、表达出来的蛋白质不能有效、正 确的折叠及二硫键配对错误 3、缺乏信号肽切除、糖基化、磷酸 化和羧化等翻译后修饰以及对原核 细胞有毒性。
2013年7月27日星期六 3
一、真核细胞表达宿主的种类及优势
不同表达系统蛋白质表达及翻译后修饰情况的比较 大肠杆菌 产率 蛋白酶消化
43
3、牛乳头瘤病毒(BPV)病毒基因组 为双链DNA，全长7095kb。能在体 外转化啮齿动物细胞，转化受体细 胞后以染色体外DNA的形式存在， 细胞中病毒DNA的拷贝数一般可达 到20~100。以BPVDNA构建的表达 载体可以在多种哺乳动物细胞中低 水平或中等水平表达。
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第一节 概述 在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质 往往只能在真核细胞表达系统中才 能获得有活性的表达产物。其原因 有：
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pTRE：与pTet-Off(或pTet-On)质粒 一起构成四环素或强力霉素诱导表达 载体系统多用于建立细胞毒性基因稳 定转染的细胞系，并研究该基因诱导 表达对细胞的影响
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b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。 c、博来霉素抗性基因： d、HPH基因：该基因编码潮霉素B磷 酸转移酶
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2）报告基因： 氯霉素乙酰转移酶(CAT) 3）表位标签 常用的表位标签有GST(谷胱甘肽转移 酶)、人IgG1的Fc区、FLAG等
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分泌蛋白新生肽链N端的一段20～ 30氨基酸残基组成的肽段。将分泌 蛋白引导进入内质网，同时这个肽 段被切除。现这一概念已扩大到决 定新生肽链在细胞中的定位或决定 某些氨基酸残基修饰的一些肽段。
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第二节外源基因在哺乳动物细胞中表达 一、哺乳动物细胞表达载体
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但该表达系统的 表达水平较低 、 培养基 昂贵、生长缓慢、含有过敏物质 等缺点在 实际应用过程中较难避免。哺乳动物细胞 表达系统通常用来生产用 常规方法无法获 得 的 真核细胞蛋白 。如EPO，TNF受体， 基因工程单抗等。 CHO（中国仓鼠卵巢）是目前重组糖蛋 白生产的首选体系。
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DNA U3 U3 R U5 R
SD Ψ gag pol
SA env U3 U3 PB(+) R U5 R
逆 病 毒 的 结 构 和 载 体 结 构
2013年7月27日星期六
PB(-) mRNA
5'
R U5
Ψ
gag
pol
env
U3
R
AAAA 3'
5'
R U5
+
env
U3
R
AAAA 3'
SD
SA
P
IRES
IRES--Internal Ribosome Entry Site
Ap
r
40
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原病毒DNA转 染进包装细胞 中，包装原病 毒产生将病毒 RNA包装成感 染性病毒粒子 的所有蛋白质 ，但却不能包 装自身的RNA
2013年7月27日星期六
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pBudCE4.1：是Invitrogen公司的一 个双启动子（CMV和EF-1α）质粒 载体，在每个启动子下游都有多克 隆位点，用此质粒可同时实现两个 基因的独立表达。若用来制备稳定 表达的细胞株，该载体可以确保相 同拷贝数的基因被同时表达。
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(4)复制子：哺乳动物基因表达载体的 复制子一般采用病毒基因组的复制子， 由于某些病毒可以在哺乳动物宿主细胞 内进行自主复制。不同的病毒复制子的 工作效率不同，常用于构建哺乳动物表 达载体的复制子有SV40、多瘤病毒和牛 乳头瘤病毒等的复制子。
2013年7月27日星期六