转基因抗虫棉的遗传转化与功能验证

转基因抗虫棉的遗传转化与功能验证

一、农杆菌介导的棉花胚胎再生遗传转化体系

（一）实验方法

以W0为受体，将pC2-dsGFP、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH3、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP载体的农杆菌菌株，运用农杆菌介导法分别将目的基因转入棉花下胚轴，通过组织培养技术获得转基因再生株系。

嫁接试验采用根系发达抗病性强的海岛棉（海7124）的实生苗做砧木，接

穗是转化基因再生植株。

（二）实验步骤

农杆菌介导的棉花遗传转化分3步，转化、胚胎发生和植株再生。

1）种子脱绒：轧花后的棉花种子，烘干（40℃左右），用适当硫酸（H2SO4）脱去短绒，自来水洗掉种子表面浓硫酸，充分晾干；

2）种子的消毒处理：选取饱满棉花种子于无菌三角瓶中，无菌水冲洗一次，70%乙醇表面消毒种子30 Sec，弃去乙醇，加入30%过氧化氢（H2O2）于摇床振荡2-3 h，弃掉H2O2，无菌水冲洗种子3-5 次，保留少量无菌水浸过种子，存放28℃，18-24 h，待到种子破壳露白；

3）外植体制备：在无菌条件下，滤掉消毒过种子的无菌水，剥去种子种壳，接种于苗培养基（1/2MS）上，28 ℃黑暗培养（N）3 d，然后在28℃、3000-5000 Lx光照下培养(D/N＝16 h/8 h) 3 d。

4）农杆菌活化与浸染液制备：将-70℃保存的农杆菌载体菌株，取出冻融。

在固体LB平板培养基上（含Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）划线，28℃静止培养1-2天。平板挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体（Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）培养基（10ml）中，28℃振荡过夜，再按1%接种量转接入50mL新鲜培养基中（含Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）培养8小时左右，测定OD600为0.5左右。4℃，5000rpm离心5min ，收集菌体。然后用5mLMSB0（含100 uM/ml AS）液体培养基重新悬浮沉淀，再转入15-45mL的MSB0（含100uM AS）液体培养基，28℃摇床上培养至OD600为0.5左右，稀释培养液OD600 值0.3-0.7 时备用。

5）浸染与共培养：在超净台上使用手术刀切割茎段7cm左右，将下胚轴茎段浸泡于农杆菌侵染液中5-8 min，用灭菌滤纸吸干胚轴段菌液，放在铺有一层灭菌滤纸的共培养培养基上，用封口膜封口，22℃～25℃共培养2d。

6）下胚轴切段两端切口长出的愈伤组织直径大约0.5-1.0 cm时切下来单独继

代，愈伤组织块的直径大约2 cm时转移到胚性愈伤组织诱导培养基上。

7）转化组织从1个或几个细胞开始分裂，3-4个月即有蚕豆大小（直径2 cm 左右）。

8）愈伤在MSB上长到直径2cm左右，接种到MSB2诱导胚性愈伤，在MSB2上继代1-3次即会有胚性愈伤的出现。

9）待愈伤组织长到直径约2-3cm 时，将其从胚轴段切除，愈伤组织块转入相同的培养基增殖，可以有效的去除农杆菌和防止愈伤组织褐化现象。

10）当愈伤组织块直径达到7-8 mm 放入胚性愈伤诱导培养基中，在培养间常规条件下培养，每隔一个月左右转一次相同的培养基，2-6 次，到出现黄绿色或灰绿色，米粒状的胚性愈伤为止。

11）只要疑似分化就挑出来少许，分散继代到分化培养基上，在分化培养基上能生存的一般是胚性愈伤组织，而非胚性愈伤在分化培养基大多不能存活。

12）由胚性愈伤再生植株经历体细胞胚的形成、成熟、萌发和小植株的生长。经过10天左右的抗性胚筛选，将成活的胚性愈伤挑到瓶口包棉塞、使用透气瓶塞培养瓶里培养，促进胚状体的形成和萌发。

13）将萌发的小植株平铺接种到铺滤纸的培养基上，诱导成苗。小植株再转入大的三角瓶中（培养基同愈伤组织增值配方），无菌条件下取小植株2－3 片叶，小量法提取DNA，进行标记基因和目的基因的PCR 扩增，将阳性小植株嫁接温室。

14）在装有营养土的土盆中种上根系发达、抗逆性强的海岛棉或育成品种（抗病、植株旺盛），待棉苗3-5 片真叶时待用（称砧木苗）。用劈接法和插皮接法将转基因再生棉株嫁接到砧木苗上（吴慎杰等，2007）。

15）嫁接后的管理：嫁接后3-4d通气，即旋开瓶盖罩住瓶口2/3，以防接穗发霉，7 d去掉瓶盖，10-12 d揭瓶，15 d左右解绳成活。为了让其快

速生长，成活后用霍格兰营养液浇一次。

（三）农杆菌介导棉花下胚轴转化

利用优化了的陆地棉体细胞再生转化体系，以转化模式品种W0为受体，利用带有目的基因的农杆菌载体菌株EHA105与棉花下胚轴进行共培养后，经过一系列的组织培养再生过程，获得大量的转基因株系。

（四）实验结果

目前，转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1、pC2-dsGFP载体转基因抗虫棉获得再生植株的情况如下，后续实验还在进行中。pC2-dsPTTH3 ：已获得20个克隆，10个克隆已嫁接成苗，有2个克隆已经拿到T1代种子。

pC2-dsPTTH5 ：已获得30个克隆，有25个克隆已出大量小苗，20个左右克隆已嫁接，其中几个克隆已结铃。

pC2-dsJHAMT ：已获得61个克隆，35个克隆已出大量小苗，嫁接20个克隆，还有小苗待嫁接。

pC2-dsJHBP1：已获得15个克隆，12个克隆嫁接，有2个克隆已经拿到T1代种子，已南繁。

pC2-dsGFP ：已获得5个克隆，其中3个克隆均嫁接成活，收到T0代种子。

1. pC2-dsPTTH3

2. pC2-dsJHAMT

3. pC2-dsPTTH5

4. pC2-dsJHBP1

5. pC2-dsGFP

二．pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT 、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1转基因株系的分子检测结果

用CTAB 法提取转基因株系叶片的基因组DNA ，以目的基因的特异性引物

进行PCR 扩增。结果如下：

（注：各载体获得的转基因后代株系，具体实验还在进行中，后续将获得更

多克隆数，并进一步进行分子检测。所以，现获得检测结果没有具体统计。）

（一）pC2-dsPTTH3

T0代验证： 1为marker ；2为阳性对照；5为加水阴性对照； 3、4、6、7、8、9、

10、11分别为转基因不同株系