细菌检验技术

靛基质试验原理
色氨酸
色氨酸酶
靛基质 （吲哚） 对二甲基氨基苯甲醛 玫瑰靛基质 （玫瑰吲哚）
靛基质试验
（二）硫化氢试验
• 原理：细菌分解蛋白质中的含硫氨基酸， 生成硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐或 铅盐结合生成黑色络合物。 • 培养基：含硫酸亚铁或醋酸铅的培养基 • 结果：培养基变黑：阳性 不变黑：阴性 • 应用：常用于肠道杆菌的鉴定
（三）甲基红试验
• 原理：细菌分解糖，产生丙酮酸，进一步生 成大量混合酸，使培养基pH维持在4.4以下， 加入甲基红（4.4-5.4）后，使甲基红呈现红 色反应。此为甲基红试验阳性。 • 培养基：葡萄糖蛋白胨水 • 试剂：甲基红试剂 • 结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+ 培养基不变色： － • 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主 要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌
压滴法
细菌悬液
盖玻片 载玻片
悬滴法
镜检
3、暗视野聚光法 4、相差显微镜检查法
（二）影响因素 1、操作因素 2、玻片因素 3、光线强度
第二节
细菌接种与培养技术
一、基本条件 （一）接种环与接种针 用于取菌、接种及分离细菌的器具 1、接种针用于挑去单个菌落、穿刺接种及 斜面接种
2、接种环用于划线分离培养、纯种接种、 挑取菌落和菌液以及制备细菌涂片。 3、接种前后都应对接种环和接种针进行灭菌
葡萄糖
V－P试验
丙酮酸
脱酸
乙酰甲基甲醇
V-P试剂
二乙酰 培养基变红
葡萄糖
丙酮酸 脱酸 大量混合酸 乙酰甲基甲醇 V-P试剂 pH降至4.4以下 甲基红试剂 培养基变红 培养基变红 二乙酰
葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径
（五）B-半乳糖苷酶试验 1、原理：有些细菌产生的B-半乳糖苷酶可分 解邻硝基酚B-半乳糖苷（ONPG）产生邻 硝基苯酚（黄色） 2、培养基：1%乳糖肉汤琼脂 3、试剂：甲苯、 ONPG 4、结果：加入ONPG后，菌悬液黄色：+ 菌悬液无色：5、应用：迟缓发酵乳糖细菌的快速检测
（六）七叶苷水解试验 1、原理：某些细菌可以分解七叶苷 七叶苷 葡萄糖+七叶素 Fe2+ 黑色沉淀 2、培养基：七叶苷培养基 3、结果： 培养基黑色：+ 培养基不变色：4、应用：D群链球菌和其他链球菌的鉴别
二、蛋白质类代谢试验
• • • • • 靛基质试验 硫化氢试验 尿素酶试验 苯丙氨酸脱氨试验 氨基酸脱羧酶试验
（二）红外接种环灭菌器 利用红外线产热进行灭菌
（三）培养皿 制备固体培养基常用的器皿，用于细菌的 分离培养。
附：微生物检验常用玻璃仪器的准备
1、玻璃器材的种类及用途 2、玻璃器皿灭菌前的准备 玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的包 裹和加塞后才能进行灭菌处理。
3、玻璃器材的清洗
★新购置的玻璃器材：1％～2％盐酸浸泡－→清水
• 原理：细菌的具有的苯丙氨酸脱氨酶，可 使培养基中的苯丙氨酸脱氨，形成苯丙酮 酸，后者与三氯化铁作用，形成绿色化合 物。 • 培养基：苯丙氨酸琼脂 • 试剂：10％三氯化铁 • 结果：加入试剂后培养基呈现绿色为阳性 • 应用：多用于肠道杆菌的鉴定
（二）细菌接种与分离技术 1、细菌接种的基本程序
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本
沾取标本
接种
灭菌接种环
杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境
2、细菌接种法 （1）平板划线接种法：
目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成 单个菌落，以便获得纯菌。
方法： 1）分区划线法：适用于含菌量较多的标本 2）连续划线法：适用于含菌量较少的标本
（三）尿素酶试验
• 原理：产生脲酶的细菌，能水解尿素生 成氨和CO2，氨使培养基呈碱性变色。 • 培养基：尿素培养基 • 试剂：酚红指示剂 • 结果：培养基变红：+ • 培养基不变色－ • 应用：肠杆菌科属间鉴定
尿素酶试验原理
尿素 尿素酶 氨+CO2 培养基pH升高
酚红呈碱性变色（红）
(四)苯丙氨酸脱氨实验
清洗 ★用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷－→清水清洗 细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷 ★盛培养基试管和平皿：高压灭菌－→趁热倒出－ →洗涤剂洗刷－→清水冲洗 ★吸管：3％来苏浸泡－→清水冲洗 ★玻片和盖玻片：3％来苏和清洁液浸泡－→清水 冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸10min再洗 涤 ★含油脂的器皿：单独灭菌
（2）化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐 有关 （3）等电点学说：与细菌所带电荷有关
5、临床意义
• 鉴别细菌 • 选择用药 • 理解细菌的致病作用
6、影响因素 （1）操作因素 ★涂片的厚薄 ★脱色时间的长短 （2）染液因素 ★卢戈碘液放置时间过长 ★ 95％乙醇挥发 ★结晶紫与草酸铵混合时间太长 （3）细菌因素： ★细菌种类、 ★细菌菌龄
（三）抗酸染色法
用于鉴别抗酸杆菌和非抗酸杆菌 步骤：1、苯酚复红加温染色 2、盐酸酒精脱色 3、亚甲蓝复染 结果：抗酸杆菌为红色 非抗酸杆菌为蓝色
（四）其他染色法 1、特殊结构染色法
2、负染色法ห้องสมุดไป่ตู้
3、荧光染色
二、细菌不染色标本镜检
• 应用：主要用于观察活菌的动力和运动方 式 • 常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野映光 法
复染法的一般步骤 初染－→媒染－→脱色－→复染
5、镜检 • 显微镜：光学显微镜 • 所用放大倍数：10×100＝1000 • 所用镜头：油镜头 • 镜油：香柏油或石蜡油 • 香柏油折光率（n＝1.515）与玻片折光率 （n＝1.52）接近 • 显微镜使用完毕须擦拭镜头。
（二）革兰染色法
1、染液组成： 结晶紫染液、卢戈碘液、95％乙醇、稀释复 红
葡萄糖
甲基红试验
丙酮酸 大量混合酸
pH降至4.4以下
甲基红试剂
培养基变红
甲基红试验
（四）伏－普试验（V-P试验） • 原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮 酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙 酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白 胨中的精氨酸所含的胍基结合，生成红色化 合物。 • 培养基：葡萄糖蛋白胨水 • 结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+ 培养基不变色： － • 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主 要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌
糖发酵试验结果判断
反应现象
酸性变色、有气泡 酸性变色、无气泡 培养基不变色
结果描述
分解××糖产酸、产气 分解××糖产酸、不产 气 不分解××糖
糖发酵试验
（二）葡萄糖氧化/发酵试验 1、原理：细菌分解葡萄糖的过程中对氧的 需求不同，分为氧化、发酵和产碱三型 单糖－→丙酮酸－→酸性产物－→pH↓ －→ 指示剂呈酸性变色 2、培养基：HL葡萄糖培养基 3、试剂：石蜡 4、结果：两管均不变色：产碱型 石蜡管变色：发酵型 非石蜡管变色：氧化型 5、应用：肠杆菌和非发酵菌的鉴别
2、培养基的种类 （1）按培养基的物理性状分类
• 液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接 种纯种细菌。 • 半固体培养基：含0.3％～0.5％琼脂，用于 观察细菌的动力。 • 固体培养基：含2％～2.5％琼脂，多用于 细菌的分离培养。
（2）按培养基的用途分类 • 基础培养基：培养营养要求不高的细菌， 如普通平板 • 营养培养基：能满足营养需求较高细菌的 生长，如血平板 • 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于 鉴别细菌，如克氏双糖培养基（KIA） • 选择培养基：具有选择性抑制作用，用于 选择性的培养目的菌，如SS平板 • 增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于 含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。 • 厌氧培养基：用于培养厌氧菌
（一）靛基质试验
• 原理：细菌产生色氨酸酶，可分解蛋白胨中 的色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与 试剂对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛 基质。 • 培养基：蛋白胨水 • 试剂：靛基质试剂（含对二甲基氨基苯甲醛） • 结果：加入试剂后，培养基出现红色液面：+ 培养基液面为黄色：－ • 应用：用于肠道杆菌的鉴定
细菌在半固体培养基中的生长现象
无动力 现象
有动力 现象
（三）细菌在固体培养基中的生长现象
• 菌落 ★定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形 成单一肉眼可见的细菌集团。 ★菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透 明度、湿润度、黏度、溶血性 ★菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型 （M） • 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。
一、碳水化合物的代谢试验
• • • • • • 糖发酵试验 葡萄糖氧化／发酵试验（O/F试验） 甲基红试验 V-P试验 七叶苷水解试验 Β－半乳糖苷渗透酶试验
（一）糖发酵试验
• 原理：不同细菌可分解不同的糖 多糖－→单糖－→丙酮酸－→酸性产物 (或产酸产气)－→pH↓ －→指示剂呈酸性 变色(若产气者有气泡出现) • 培养基：糖发酵管、半固体发酵管、微 量发酵管 • 试剂：酚红、溴甲酚紫等 • 结果:培养基呈酸性变色（红 黄） • 应用：观察细菌对糖的分解情况，常用 于肠道杆菌的鉴定
2、染色方法
• 标本涂片，固定
– 结晶紫初染 （1分钟）→ – 碘液媒染（1分钟） → – 95%乙醇脱色（30秒）→ – 复红复染（3-5分钟） →
3、染色结果 • 兰阳性菌（G+）——紫色； • 革兰阴性菌 (G-) ——红色。
4、染色原理 （1）渗透学说：与肽聚糖结构有关 G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种 透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔 障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。 呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不 能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解， 缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，复 红复染后呈红色。
（四）培养箱
1、电热恒温培养箱 2、二氧化碳培养箱 3、厌氧培养箱
（五）培养基 培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁 殖的综合营养基质。 1、培养基的成分及作用 • 营养物质：肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血 液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐 • 水 • 凝固剂：琼脂、明胶 • 抑制剂 • 指示剂
三、细菌的生长现象 （一）细菌在液体培养基中的生长现象
• 混浊 • 沉淀：多见于链状排列的细菌 • 菌膜：多见于厌氧菌
细菌在液体培养基中的生长现象
（二）细菌在半固体培养基中的生长现象
• 有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外 扩散生长，穿刺线边缘模糊。 • 无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边 缘清晰。
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
连续划线法
（2）液体培养基接种法 （3）穿刺接种法 :用于观察细菌动力 （4）斜面接种法 （5）倾注培养法:用于细菌计数 （6）涂布接种法：见于药敏试验
（三）细菌的培养方法 • 一般培养（需氧培养）： ★培养温度：35℃（采用恒温培养箱） ★培养时间：18～24h • 二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养 箱、化学法 • 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧 罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等
第五章 细菌检验技术
第一节
细菌形态检验技术
一、细菌染色标本镜检
（一）染色标本检查的基本程序 1、涂片 2、干燥 3、固定 4、染色 染料种类：碱性染料、酸性染料、中性染 料， 碱性染料最常用
（1）单染法 用一种染料进行染色，可观察细菌的大小、 形态和排列，但不能用于鉴别细菌。如：亚 甲蓝染色法 （2）复染法 用两种或两种以上的染料进行染色，不仅可 以观察细菌的大小、形态和排列。还可用于 鉴别细菌，又称为鉴别染色。 • 鉴别染色—革兰染色 抗酸染色
菌落
菌落与菌苔
第三节 细菌生化鉴定技术
细菌的生化反应：细菌具有各自独特的酶系 统，因而在代谢过程中对底物的分解能力不 同，所产生的代谢产物也不同，这些代谢产 物各具有不同的生物化学特点，利用生物化 学的方法来检验这些代谢产物，可用于鉴别 和鉴定细菌，这种用生化反应测定方法称为 细菌的生化反应。
3、培养基制备的一般程序
调配
培养基灭菌
★ 基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟
溶化
矫正pH
★ 含糖培养基：113
℃灭菌15分钟
过滤澄清 分装 灭菌 检定
★ 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次
★ 不耐高温的液体成分：滤过除菌
保存
二、细菌接种与培养技术 （一）无菌技术 1、细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台 内进行。 2、无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。 3、细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌 4、无菌试管、烧瓶、吸管的使用 5、标本的采集 6、废弃物的处理 8、个人防护