乳鼠心肌细胞培养

大鼠心肌细胞培养
一、乳鼠原代心肌细胞培养
（一）、试液配制
1．DMEM培养液：配制方法同前。

按每90ml 培养液加入10ml 胎牛血清即为10%DMEM 培养液。

2．0.1%胰酶：移取0.5g 胰酶，加入５00ml 生理盐水，充分溶解后，调pH至７.2~7.4,过滤除菌后，分装冻存于-２０℃。

3．１0mmol/L 5-溴脱氧尿苷：
（二）、操作步骤
１．取１天龄的新生乳鼠，断头处死，固定于泡沫板上；
２．应用碘酊及７０％酒精常规消毒；
３．从左侧肋下缘剪开胸腔，用镊子取出心脏，置入含无血清DMEM培养液的平皿中；
４．全部心脏取出后，剪去心房及周围血管组织，移入一干平皿中；
５．剪碎，用无血清培养液洗１～２遍后，转移入５０ml 离心管中；
６．按３０～５０个心脏加１０～1５ml胰酶液，于３２～３５℃，不停搅动１５０～２００rpm,消化１５～２０min;
７．让组织块自然沉淀，上清移入另一离心管中，立即加入等量含１０％血清的培养液以终止胰酶的作用。

最初２～３次消化液因含较多的细胞碎片及红细胞，可弃去。

８．组织块可反复加入胰酶消化５～８次，所得细胞悬液在１０００rpm离心５min , 弃去上清，沉淀用少量培养液重悬；
９．细胞计数后，将细胞稀释成１×106cells/ml的浓度，转移入培养瓶中，３０cm2的培养瓶加入５ml ，轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分布；
10.37℃95%空气－５％CO2条件下培养１h，然后轻轻摇动，将未贴壁的细胞转移到
新的培养瓶中继续培养；
11.２4h后更换含０.1mmol５－溴脱氧尿苷的培养液，以后每２天更换一次培养液。

心肌细胞全部汇合，自主搏动良好即可用于实验。

（三）、注意事项
１．心脏是由多种细胞群组成的，心肌细胞约占５０％。

决定心肌细胞培养成败的关键是：１）不能污染，在整个操作过程中都要注意无菌操作，所用器皿都要严格消毒，所用试液都
要预先检验无菌后方可使用。

２）尽量减少非心肌细胞的存在。

为了获得纯化的心肌细胞，可以采取差速贴壁及应用DNA抑制剂等办法。

因心肌细胞需１２～１５h后才开始粘附并伸展，而其它非心肌细胞包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、血细胞等贴壁较快，因此通过差速贴壁可以去除大部分非心肌细胞；在紫外光照射后，应用５－溴脱氧尿苷，可以杀灭所有的分裂细胞。

除了以上措施外，以下几点也须注意：１）要尽量使用刚出生的乳鼠；２）要尽量去除心房及周围血管组织；３）培养液所含血清浓度不宜过高，以6－１０％为宜，血清易促进非心肌细胞的生长。

2.心肌细胞的鉴定主要通过形态观察及免疫组化染色。

相差显微镜下心肌细胞呈多角形伸展，中间较厚，可自然搏动；心肌细胞汇合后，可出现同步性搏动。

3.心肌细胞分离的关键问题是胰酶的浓度。

浓度太高，细胞受到损伤，破裂，碎片增多，浓度太低心肌细胞不易分离下来。

一般用1：250的粗制胰酶，0.05~0.1%的浓度即可。

二、成年大鼠心肌细胞的分离及培养
（一）、实验准备
1．Langendorff装置：如图所示，用灌流泵将缓冲液泵入保温杯中，通过三通2调节保温杯内液面。

在流出道外口装压力换能器，经显示器监测压力变化。

通过灌流泵的流速。

调节基础压力的大小。

2．K-H液（mmol/L）：NaCl 130，KCl 4.8，MgSO4 1.2，NaHCO3 2.5，NaH2PO4·H2O 1.2，Glucose 12.5，HEPES 12，PH=7.4，。

3．胶原酶液-1：collagenase II 0.43mg/ml（273u/mg），hyaluronidase 0.3mg/ml，溶于无Ca2+的K-H液中。

4．胶原酶液-2：trypsin 2mg/ml, DNase 0.2mg/ml溶于胶原酶液-1中。

二、操作步骤
1．大鼠经苯巴比妥纳30mg/kg ip麻醉，1000u/ml肝素0.3~0.4ml iv；
2．开胸取心脏，用37℃K-H液洗2次；
3．立即将心脏悬吊于Langendorff装置上；用K-H液以4.656~5.320 KP a压力（7-8 ml/min）经主动脉逆行灌流心脏5min；
4．用50ml胶厚酶液-1循环灌注心脏20min。

3min后压力渐升至7.980~9.310KPa,然后又降至5.985Kpa左右；
5．继用胶原酶液-2 20ml循环灌流10min；
6．取下心脏，在含0.2% BSA，0.3mmol/L Ca2+的K-H液中剪去心房及左心室。

将左心室剪成数片，用针头轻轻划碎后洗3次。

10~15min后弃上清，用5ml含0.6 mmol/L Ca2+的K-H 液洗沉降之细胞；10min后再用含1.0mmol/LCa2+的K-H液洗细胞，让细胞沉降3-7min，弃上清；细胞用含200umol/L Ca2+的K-H液重悬。

7．细胞在室温（22-23℃）下保存，直到使用，此细胞正常情况下可连续跳动4-8h。

（三）、注意事项
1．成年心肌细胞互相之间以间盘（intercalated disc）连接，且穿插入细胞外基质的网络中，因此较难分离。

应用胶原酶消化分离出的心肌细胞在产量及活力方面受胶原酶，缓冲液成分，PH，温度，灌流量及消化时间的影响。

2．本方法同样适用于小鼠、狗、羊及人心肌细胞的分离。

但不同种属，不同年龄的动物消化条件要作适当调整。

3．胶原酶是分离心肌细胞的最主要成份，厂家、活性、批号都对实验有较大影响。

用一种新批号，要经过一段预试，才能确定最佳浓度。

一旦确定下来，不宜随意改变。

胶原酶II 比I的消化力强得多。

各动物种属的敏感性也不一样，可根据条件及经验调整配方。

胶原酶需要Ca2+的激活，有人在酶溶液中加入微量的Ca2+（30-200umol/L），但不加Ca2+也可得到形态功能很好的细胞，可能由于内源性Ca2+足以激活胶原酶之故。

4．白蛋白具有保护细胞膜的作用，可减轻酶对细胞的损伤。

另一方面，通过悬浮作用，使细胞较易与细胞碎片分离开来，得到清晰的细胞。

但白蛋白浓度过大，会抑制细胞的兴奋性。

5．Ca2+：心肌细胞是在无Ca2+或微Ca2+条件下分离的，这是因为Ca2+是维持细胞外基质功能的重要成份，用无Ca2+液灌注后，有利于心肌细胞从细胞外基质中分离出来。

但要使心肌细胞具有收缩功能，应在心肌细胞分离出来后半小时内，逐渐增加Ca2+至生理浓度。

若得到细胞后不及时复钙，随着时间的延长，细胞的兴奋性和收缩性会下降。

6．溶液：水的质量很重要。

离子及有机分子的污染均可显著影响分离的效果。

应用双蒸去离子水。

台氏液可用于小鼠，也可用于大鼠。

K-H液可用于大鼠、兔、狗、羊，也可用于小鼠，对细胞产量无太大的影响。

7．温度：大鼠及小鼠心脏从胸腔取出后，应用温（33℃）台氏液洗两次。

此时若用4℃台氏液洗，由于主动脉收缩，会使插管变得很困难。

用温台氏液，心脏仍有些搏动，易于分辨主动脉并插管。

狗、羊及人心脏标本可在0~4℃营养液中保存12h，仍能分离到有收缩功能的细胞。

已分离到的细胞在室温（22-23℃）比在37℃，其有更稳定的兴奋性和收缩性。