农杆菌介导的植物遗传转化研究进展
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生物技术进展 2011 年 第 1 卷 第 4 期 260 ～ 265
Current Biotechnology ISSN 2095-2341
Fra Baidu bibliotek
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进展评述
Reviews
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农杆菌介导的植物遗传转化研究进展
姚 冉1，2 ， 石美丽1 ， 潘沈元1 ， 沈桂芳2 ， 张志芳2*
农杆菌属于革兰氏阴性土壤杆菌，分根癌农
杆菌 （ Agrobacterium tumefaciens ） 和 发 根 农 杆 菌 （ Agrobacterium rhizogenes） 。根癌农杆菌中含有 Ti 质粒，能诱发冠瘿瘤。发根农杆菌中含有 Ri 质 粒，可以 导 致 受 伤 部 位 产 生 毛 发 状 根。Ti 质 粒 （ 包括 Ri 质 粒 ） 上 有 一 段 转 移 DNA （ transfer DNA，又称 T-DNA） ，受伤的植物细胞中产生的化 学复合物可使农杆菌吸附于植物上，使 T-DNA 转 移到植物细胞内并整合到染色体上。
1． 2 农杆菌转化的载体系统 农杆菌介导的遗传转化系统都是以农杆菌能
将其 Ti 质粒上的 T-DNA 插入植物基因组中引起 植物遗传特性变异这一原理为基础。常用的有共 整合载体系统和双元载体系统。
共整合载体系统包括一个 Ti 质粒和一个较 小的中间载体。在农杆菌中，中间载体与 Ti 质粒 借助 T-DNA 边界部位进行同源序列重组，目的基 因就被整合到 Ti 质粒的 T-DNA 区中，形成一个 共整合质粒。这个共整合载体携带的基因可以通 过共培养转移进入植物组织细胞。隔端载体系统 （ split-end vector，SEV） 是一种改良的共整合载体 系统。它的 左 右 边 界 分 别 位 于 两 个 独 立 的 质 粒 上，只要经 过 一 次 重 组，就 能 形 成 一 个 共 整 合 质 粒，而其他共整合系统需要两次同源重组［8］。在 设计载体系统时，必须考虑共整合之后质粒的稳 定性。
目前大量研究工作的目标是明确农杆菌将外 源 DNA 导入受体细胞的分子机制，从而改进农杆 菌菌株、质 粒 和 转 化 技 术，以 进 一 步 提 高 转 化 效 率。由于植物受体在转化过程中的作用尚不十分 明确，所以农杆菌在转化过程中如何进入植物细
收稿日期： 2011-08-30； 接受日期： 2011-10-11 基金项目： 国家自然科学基因项目（ 31070139） 资助。 作者简介： 姚 冉，硕士研究生，研究方向为遗传学。* 通讯作者： 张志芳，研究员，博士，博士生导师，主要从事基因工程研究。E-mail：
Key words： Agrobacterium tumefaciens； genetic transformation； progress
植物 遗 传 转 化 （ plant genetic transformation） 技术也称植物转基因技术，是应用 DNA 重组技术 将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植 物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的植 物遗传 改 良 的 一 门 技 术［1］。 目 前 最 常 用 的 转 基 因方法是基因枪法和农杆菌法。基因枪法的基本 原理是利用表面附着有外源 DNA 的金属微粒在 高压装置中加速后高速运动到受体细胞中，从而 达到转化 DNA 的目的。但是基因枪法与农杆菌 介导法相比，存在着转化率低、外源 DNA 整合机 理不清楚、得到的转化体往往是嵌合体、遗传稳定 性较差、转入外源基因的沉默现象突出等缺点。
1． 徐州师范大学生命科学学院，江苏 徐州 221116 2． 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081
摘 要： 农杆菌介导的转基因方法是目前植物遗传转化的重要方法之一。本文从农杆菌转化原理、菌株比较及载体发 展入手，系统讨论了植物转化受体对转化效率的影响，同时分别综述了农杆菌介导转化技术在双子叶和单子叶植物转化 应用中的最新进展。 关键词： 农杆菌； 遗传转化； 进展 DOI： 10． 3969 / j． issn． 2095-2341． 2011． 04． 06
因的特异性表达。因为在农杆菌介导的遗传转化 早期阶段植物基因的表达在一定程度上是被抑制 的，所以提高难转化物种的转化效率的主要途径 之一就是对植物基因差异表达的研究。
Ditt 等［12］研 究 了 藿 香 蓟 悬 浮 细 胞 培 养 对 非 致瘤的超毒农杆菌株系侵染的响应。使用 cDNA 扩增片段长度多态性（ AFLP） 来扩增 16 000 个片 段，发现 48 h 后 有 251 段 基 因 差 异 调 节 侵 染 过 程。逆转录 PCR 分析其中部分基因证实了cDNAAFLP 分析的结果。对其中大部分基因 （ 例如编 码一种 RNA 酶、一种假定受体激酶、一种过氧化 物酶和一种病程相关蛋白的基因） 的研究表明， 随着大肠杆菌进入植物细胞，经过一段潜伏期后 均出现了差异调节，有 4 种基因（ 包括一个编码根 瘤素样蛋白的基因） 对特定的农杆菌侵染做出了 响应。从而推测可以根据这个根瘤素基因对细菌 信号的响应来区分常规植物细胞和变异物种。
2 植物遗传转化受体对转化效率的影响
通过不断优化转化菌株系统可以有效地提高 农杆菌对植物的转化效率，另一方面，对植物受体 在侵染过程中的作用的研究也有助于转化效率的 提高。
262
生物技术进展 Current Biotechnology
2． 1 植物对农杆菌侵染的响应 植物对农杆菌侵染的响应主要表现在植物基
Gelvin 实验室使用 5 种不同的非致瘤农杆菌 菌株侵染烟草 BY-2 悬浮细胞［6］，结果显示一个 菌株可以转化 T-DNA 但不转化 VirE2，一种可以 转化毒性蛋白但不转化 T-DNA，还有一种二者都 不转化，另外两种则都可以转化。在侵染后 8 个 不同的时间点（ 0 ～ 36 h） 用中心化减法杂交 RNA 样品鉴别出超过 400 种基因在侵染后各个时期出 现差异调节。其中一些基因对 T-DNA 和毒性蛋 白有转化能力的菌株有明确的响应，还有一小部 分的基因则特定地针对 T-DNA 或毒性蛋白的转 化产生响应。在响应过程中，表达量维持在较高 水平的是那些编码组蛋白和核糖体蛋白的基因。 有几种植物防御活动和应激反应基因被农杆菌侵 染所抑制。因此植物中对农杆菌侵染有响应的基 因表达对转化过程而言是必须的，对这些表达基 因的更深入的分析表明，它们均直接或间接地参 与农杆菌介导的植物转化过程。
双元载体系统也由两个质粒组成： 一个辅助 性质粒（ 约 100 kb） ，含有 Vir 区； 另一个称为穿梭 质粒，这个质粒相对小得多（ 10 kb 左右） ，含有 TDNA 边界序列、广谱寄主范围、抗生素抗性标记 基因及外源基因的多克隆位点，这使得穿梭质粒 能够利用大肠杆菌方便地进行体外操作和构建工 作，并且保证了其在大肠杆菌和农杆菌中都具有 功能。双元系统的特点是两个质粒在接合后可以 共存于同一农杆菌细胞中。因为 Vir 区和 T-DNA 是反式作用的，所以 Vir 区与 T-DNA 区位于两个 质粒上 而 不 影 响 两 者 的 相 互 作 用。 超 双 元 载 体 （ super-binary vector） 系统是在双元载体系统的基 础上发展出来的。超双元载体具备了双元载体的 一些优点，并且携带有超毒性区，所以同时也具备 了超毒的性质。目前许多文献报道使用的都是双 元载体或改进的双元载体系统［9 ～ 11］，由于省去 TDNA 整合这个步骤，双元穿梭质粒从大肠杆菌转 移进入农杆菌的频率比共整合质粒高 10 000 倍。 基于这些优点，人们开发出了大量的双元载体。
1． 1 农杆菌转化系统的转化过程 转化过程主要包括 10 个步骤： ①农杆菌识别
并吸附受体细胞； ②农杆菌 VirA 和 VirG 蛋白组 成信号转导系统诱导植物产生明确的应答信号； ③vir 基因区的活化； ④ VirD1 / D2 蛋白复合体复 制 T-DNA 产生 T-链； ⑤几种 Vir 蛋白共同作用使 VirD2-DNA 复合体（ 未成熟的 T-DNA 复合体） 进 入受体细胞细胞质； ⑥VirE2 与 T-链结合形成成 熟的 T-DNA 复合体并且穿过受体细胞质到达细 胞核； ⑦T-DNA 复合体通过主动运输由核孔进入 受体细胞核［7］； ⑧T-DNA 进入细胞核后达到可以 整合的程度； ⑨T-复合体除去护卫蛋白； ⑩T-DNA 整合进入受体基因组。T-DNA 区内的基因表达 调控序列与真核生物类似，因而可以在植物细胞 中表达。该转化过程在 20 世纪 80 年代就基本确 定，其机理研究已进入基因组水平［6］。
1 农杆菌介导的遗传转化体系
农杆菌转化是将 T-DNA 随机地整合到植物 受体 细 胞 基 因 组 中［3］。 将 农 杆 菌 中 原 始 的 TDNA 替换成目的基因是如今将外源基因引入植 物体内的最有效方法。因此，与农杆菌有关的生 物学和生物技术在过去的几十年里是转基因研究 的一个热点［4］。
T-DNA 转化进入受体细胞所涉及的蛋白质 由细菌染色体和 Ti 质粒毒性区基因编码。此外， 有多种植物蛋白质也参与了农杆菌介导的基因转 化过程，主要作用于 T-DNA 胞内运输、进入细胞 核以及整合阶段。因为农杆菌主要利用在植物细 胞内的过程（ 例如 DNA 和蛋白质运输、靶蛋白水 解和 DNA 修复） 来转化其受体［5，6］，理解这些常 规的植物细胞生物学机制有助于扩展农杆菌的受 体范围，同样也可促进转化过程和转基因植物的 产物控制。改善植物受体以提高较难转化的植物 物种的转化效率是目前研究的主要方向之一。
Progress on Agrobacterium tumefaciens-mediated Plant Transformation
YAO Ran1，2 ，SHI Mei-li1 ，PAN Shen-yuan1 ，SHEN Gui-fang2 ，ZHANG Zhi-fang2*
1． School of Life Science，Xuzhou Normal University，Jiangsu Xuzhou 221116，China 2． Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China
Abstract： In current，Agrobacterium-mediated gene transferring is one of major methods used in genetic transformation of plants． This paper systematically reviewed the effect on plant transformation efficiency based on the introduction of the principle of this transformation，comparison among different kinds of Agrobacterium strains and the development to transformation vectors． In addition，the newly progresses on the Agrobacterium-mediated transformation of dicotyledonous and monocotyledons species transformation were also discussed，respectively．
zhangzf@ mail． caas． net． cn
姚 冉，等： 农杆菌介导的植物遗传转化研究进展 261
胞和在植物细胞内的转化过程是当前研究的热 点。受体细胞识别和胞内过程的研究可以使转化 技术和方法取得突破性的发展，从而扩大农杆菌 的受体范围并控制转化过程和转基因植物生产的 成果，对未来植物生物技术和植物遗传工程的发 展具有重大意义［2］。
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生物技术进展 2011 年 第 1 卷 第 4 期 260 ～ 265
Current Biotechnology ISSN 2095-2341
Fra Baidu bibliotek
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进展评述
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农杆菌介导的植物遗传转化研究进展
姚 冉1，2 ， 石美丽1 ， 潘沈元1 ， 沈桂芳2 ， 张志芳2*
农杆菌属于革兰氏阴性土壤杆菌，分根癌农
杆菌 （ Agrobacterium tumefaciens ） 和 发 根 农 杆 菌 （ Agrobacterium rhizogenes） 。根癌农杆菌中含有 Ti 质粒，能诱发冠瘿瘤。发根农杆菌中含有 Ri 质 粒，可以 导 致 受 伤 部 位 产 生 毛 发 状 根。Ti 质 粒 （ 包括 Ri 质 粒 ） 上 有 一 段 转 移 DNA （ transfer DNA，又称 T-DNA） ，受伤的植物细胞中产生的化 学复合物可使农杆菌吸附于植物上，使 T-DNA 转 移到植物细胞内并整合到染色体上。
1． 2 农杆菌转化的载体系统 农杆菌介导的遗传转化系统都是以农杆菌能
将其 Ti 质粒上的 T-DNA 插入植物基因组中引起 植物遗传特性变异这一原理为基础。常用的有共 整合载体系统和双元载体系统。
共整合载体系统包括一个 Ti 质粒和一个较 小的中间载体。在农杆菌中，中间载体与 Ti 质粒 借助 T-DNA 边界部位进行同源序列重组，目的基 因就被整合到 Ti 质粒的 T-DNA 区中，形成一个 共整合质粒。这个共整合载体携带的基因可以通 过共培养转移进入植物组织细胞。隔端载体系统 （ split-end vector，SEV） 是一种改良的共整合载体 系统。它的 左 右 边 界 分 别 位 于 两 个 独 立 的 质 粒 上，只要经 过 一 次 重 组，就 能 形 成 一 个 共 整 合 质 粒，而其他共整合系统需要两次同源重组［8］。在 设计载体系统时，必须考虑共整合之后质粒的稳 定性。
目前大量研究工作的目标是明确农杆菌将外 源 DNA 导入受体细胞的分子机制，从而改进农杆 菌菌株、质 粒 和 转 化 技 术，以 进 一 步 提 高 转 化 效 率。由于植物受体在转化过程中的作用尚不十分 明确，所以农杆菌在转化过程中如何进入植物细
收稿日期： 2011-08-30； 接受日期： 2011-10-11 基金项目： 国家自然科学基因项目（ 31070139） 资助。 作者简介： 姚 冉，硕士研究生，研究方向为遗传学。* 通讯作者： 张志芳，研究员，博士，博士生导师，主要从事基因工程研究。E-mail：
Key words： Agrobacterium tumefaciens； genetic transformation； progress
植物 遗 传 转 化 （ plant genetic transformation） 技术也称植物转基因技术，是应用 DNA 重组技术 将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植 物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的植 物遗传 改 良 的 一 门 技 术［1］。 目 前 最 常 用 的 转 基 因方法是基因枪法和农杆菌法。基因枪法的基本 原理是利用表面附着有外源 DNA 的金属微粒在 高压装置中加速后高速运动到受体细胞中，从而 达到转化 DNA 的目的。但是基因枪法与农杆菌 介导法相比，存在着转化率低、外源 DNA 整合机 理不清楚、得到的转化体往往是嵌合体、遗传稳定 性较差、转入外源基因的沉默现象突出等缺点。
1． 徐州师范大学生命科学学院，江苏 徐州 221116 2． 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081
摘 要： 农杆菌介导的转基因方法是目前植物遗传转化的重要方法之一。本文从农杆菌转化原理、菌株比较及载体发 展入手，系统讨论了植物转化受体对转化效率的影响，同时分别综述了农杆菌介导转化技术在双子叶和单子叶植物转化 应用中的最新进展。 关键词： 农杆菌； 遗传转化； 进展 DOI： 10． 3969 / j． issn． 2095-2341． 2011． 04． 06
因的特异性表达。因为在农杆菌介导的遗传转化 早期阶段植物基因的表达在一定程度上是被抑制 的，所以提高难转化物种的转化效率的主要途径 之一就是对植物基因差异表达的研究。
Ditt 等［12］研 究 了 藿 香 蓟 悬 浮 细 胞 培 养 对 非 致瘤的超毒农杆菌株系侵染的响应。使用 cDNA 扩增片段长度多态性（ AFLP） 来扩增 16 000 个片 段，发现 48 h 后 有 251 段 基 因 差 异 调 节 侵 染 过 程。逆转录 PCR 分析其中部分基因证实了cDNAAFLP 分析的结果。对其中大部分基因 （ 例如编 码一种 RNA 酶、一种假定受体激酶、一种过氧化 物酶和一种病程相关蛋白的基因） 的研究表明， 随着大肠杆菌进入植物细胞，经过一段潜伏期后 均出现了差异调节，有 4 种基因（ 包括一个编码根 瘤素样蛋白的基因） 对特定的农杆菌侵染做出了 响应。从而推测可以根据这个根瘤素基因对细菌 信号的响应来区分常规植物细胞和变异物种。
2 植物遗传转化受体对转化效率的影响
通过不断优化转化菌株系统可以有效地提高 农杆菌对植物的转化效率，另一方面，对植物受体 在侵染过程中的作用的研究也有助于转化效率的 提高。
262
生物技术进展 Current Biotechnology
2． 1 植物对农杆菌侵染的响应 植物对农杆菌侵染的响应主要表现在植物基
Gelvin 实验室使用 5 种不同的非致瘤农杆菌 菌株侵染烟草 BY-2 悬浮细胞［6］，结果显示一个 菌株可以转化 T-DNA 但不转化 VirE2，一种可以 转化毒性蛋白但不转化 T-DNA，还有一种二者都 不转化，另外两种则都可以转化。在侵染后 8 个 不同的时间点（ 0 ～ 36 h） 用中心化减法杂交 RNA 样品鉴别出超过 400 种基因在侵染后各个时期出 现差异调节。其中一些基因对 T-DNA 和毒性蛋 白有转化能力的菌株有明确的响应，还有一小部 分的基因则特定地针对 T-DNA 或毒性蛋白的转 化产生响应。在响应过程中，表达量维持在较高 水平的是那些编码组蛋白和核糖体蛋白的基因。 有几种植物防御活动和应激反应基因被农杆菌侵 染所抑制。因此植物中对农杆菌侵染有响应的基 因表达对转化过程而言是必须的，对这些表达基 因的更深入的分析表明，它们均直接或间接地参 与农杆菌介导的植物转化过程。
双元载体系统也由两个质粒组成： 一个辅助 性质粒（ 约 100 kb） ，含有 Vir 区； 另一个称为穿梭 质粒，这个质粒相对小得多（ 10 kb 左右） ，含有 TDNA 边界序列、广谱寄主范围、抗生素抗性标记 基因及外源基因的多克隆位点，这使得穿梭质粒 能够利用大肠杆菌方便地进行体外操作和构建工 作，并且保证了其在大肠杆菌和农杆菌中都具有 功能。双元系统的特点是两个质粒在接合后可以 共存于同一农杆菌细胞中。因为 Vir 区和 T-DNA 是反式作用的，所以 Vir 区与 T-DNA 区位于两个 质粒上 而 不 影 响 两 者 的 相 互 作 用。 超 双 元 载 体 （ super-binary vector） 系统是在双元载体系统的基 础上发展出来的。超双元载体具备了双元载体的 一些优点，并且携带有超毒性区，所以同时也具备 了超毒的性质。目前许多文献报道使用的都是双 元载体或改进的双元载体系统［9 ～ 11］，由于省去 TDNA 整合这个步骤，双元穿梭质粒从大肠杆菌转 移进入农杆菌的频率比共整合质粒高 10 000 倍。 基于这些优点，人们开发出了大量的双元载体。
1． 1 农杆菌转化系统的转化过程 转化过程主要包括 10 个步骤： ①农杆菌识别
并吸附受体细胞； ②农杆菌 VirA 和 VirG 蛋白组 成信号转导系统诱导植物产生明确的应答信号； ③vir 基因区的活化； ④ VirD1 / D2 蛋白复合体复 制 T-DNA 产生 T-链； ⑤几种 Vir 蛋白共同作用使 VirD2-DNA 复合体（ 未成熟的 T-DNA 复合体） 进 入受体细胞细胞质； ⑥VirE2 与 T-链结合形成成 熟的 T-DNA 复合体并且穿过受体细胞质到达细 胞核； ⑦T-DNA 复合体通过主动运输由核孔进入 受体细胞核［7］； ⑧T-DNA 进入细胞核后达到可以 整合的程度； ⑨T-复合体除去护卫蛋白； ⑩T-DNA 整合进入受体基因组。T-DNA 区内的基因表达 调控序列与真核生物类似，因而可以在植物细胞 中表达。该转化过程在 20 世纪 80 年代就基本确 定，其机理研究已进入基因组水平［6］。
1 农杆菌介导的遗传转化体系
农杆菌转化是将 T-DNA 随机地整合到植物 受体 细 胞 基 因 组 中［3］。 将 农 杆 菌 中 原 始 的 TDNA 替换成目的基因是如今将外源基因引入植 物体内的最有效方法。因此，与农杆菌有关的生 物学和生物技术在过去的几十年里是转基因研究 的一个热点［4］。
T-DNA 转化进入受体细胞所涉及的蛋白质 由细菌染色体和 Ti 质粒毒性区基因编码。此外， 有多种植物蛋白质也参与了农杆菌介导的基因转 化过程，主要作用于 T-DNA 胞内运输、进入细胞 核以及整合阶段。因为农杆菌主要利用在植物细 胞内的过程（ 例如 DNA 和蛋白质运输、靶蛋白水 解和 DNA 修复） 来转化其受体［5，6］，理解这些常 规的植物细胞生物学机制有助于扩展农杆菌的受 体范围，同样也可促进转化过程和转基因植物的 产物控制。改善植物受体以提高较难转化的植物 物种的转化效率是目前研究的主要方向之一。
Progress on Agrobacterium tumefaciens-mediated Plant Transformation
YAO Ran1，2 ，SHI Mei-li1 ，PAN Shen-yuan1 ，SHEN Gui-fang2 ，ZHANG Zhi-fang2*
1． School of Life Science，Xuzhou Normal University，Jiangsu Xuzhou 221116，China 2． Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China
Abstract： In current，Agrobacterium-mediated gene transferring is one of major methods used in genetic transformation of plants． This paper systematically reviewed the effect on plant transformation efficiency based on the introduction of the principle of this transformation，comparison among different kinds of Agrobacterium strains and the development to transformation vectors． In addition，the newly progresses on the Agrobacterium-mediated transformation of dicotyledonous and monocotyledons species transformation were also discussed，respectively．
zhangzf@ mail． caas． net． cn
姚 冉，等： 农杆菌介导的植物遗传转化研究进展 261
胞和在植物细胞内的转化过程是当前研究的热 点。受体细胞识别和胞内过程的研究可以使转化 技术和方法取得突破性的发展，从而扩大农杆菌 的受体范围并控制转化过程和转基因植物生产的 成果，对未来植物生物技术和植物遗传工程的发 展具有重大意义［2］。