微生物实验技术-04 实验四 产中性蛋白酶芽孢杆菌的分类鉴定
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-5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息 用于分类研究；
-23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析 较困难。
3、16S rDNA的特点
-16S rRNA普遍存在于原核生物中；
-在 16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有 中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不 同的各类生物亲缘关系的研究
V1: 61-106bp V2: 121-240bp V3: 436-500bp V4: 588-671bp V5: 734-754bp
V6: 829-827bp V7: 990-1045bp V8: 1118-1160bp V9: 1240-1298bp V10: 1410-1492bp
5、常用的16SrDNA扩增引物
-16S rRNA的相对分子量大小适中，约1540 个核苷酸，便 于序列分析。
-可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所 以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来， 利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类 鉴定。
4、16S rDNA的序列组成
V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应 ，在肠道菌的鉴定上尤为重要。
绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源 ，但在分解糖类物质的能力上差别很大。有的能 产酸和气体，有的只产酸不产气。
发酵产酸时，溴甲酚紫（pH6.8）变为黄色 （pH5.2）。气体的产生可以由倒扣的杜氏小管 中有无气泡来证明。
3、MR（甲基红试验）
液，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板 观察菌落周围有没有透明圈出现。透明圈和菌落的直径大小可以
初步判断菌体解淀粉的活性。
2、糖发酵试验
用记号笔在装有糖发酵培养基的试管壁上分别表明培养基名称和 所接种的细菌菌名。
取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入大肠杆菌、枯草杆菌、 普通变形杆菌，对照不接种。另取乳糖发酵培养基试管3支，操 作同上。
五、参考文献（举例）
第二次实验：
（一）接种： 将活化好的菌种接种到鉴定培养基中 按照要求进行培养。 观察记录其菌落形态、菌体形态 革兰氏染色
第三次实验：
（一）完成菌种鉴定实验
理化指标（淀粉水解、糖发酵、MR、VP）
（二）菌种生长曲线试验准备
三、数据结果
四、讨论分析
分类鉴定的程序 分类鉴定指标的确定 ……
一、16S rDNA的特点
1、16S rDNA 与16S rRNA的关系
-16SrDNA 是编码原核生物核糖体RNA小亚基16SrRNA 的基 因，与细菌整个基因组的变化相比，它具有高度的保守性。
-细菌的rRNA 含量大，约占细菌总RNA量的80%，是组成细 菌核糖体的基本组成部分。编码rRNA 的基因是按5′-16S23S-5S-3′方式排列的, 由两个非编码的间隔区序列所分开。
由于细胞化学成分及分子结构的稳定性好 ，因此化学分类是原核微生物系统分类学的主 要方法之一。
3、化学分类的常用方法
细胞（壁）化学组分分析 枝菌酸分析（诺卡氏菌） 磷酸类脂分析 脂肪酸组分分析 醌组分分析 全细胞蛋白SDS-PAGE分析 核糖体蛋白双向凝胶电泳（2D-PAGE）
4、分子分类
从分子水平上，对生物个体的DNA、RNA和蛋白质进 行研究，并根据获得的基因型信息对生物个体进行分 类的方法。
DNA G+Ｃmol% DNA 分子指纹分析 DNA-DNA杂交 核酸序列分析（16srDNA、ITS等）
利用16S rDNA序列测序的方法 对细菌进行种属鉴定
内容
一、16S rDNA的特点 二、用于细菌种属鉴定的步骤
实验材料
1. 菌种 待鉴定菌株：分离物； 参比菌株：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等 2、培养基 3、仪器或其他用具
1. 淀粉水解试验
将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃，无菌操作制成平板。 用记号笔在平板底步划成三部分，将枯草、大肠杆菌、变形杆菌
等分别划线接种，并在平板背面标注菌种名称。 37 ℃倒置培养24-48小时 观察各种细菌的生长情况。将平板打开盖子，滴入少量Lugol’s碘
一、目的意义 二、材料方法 三、数据结果 四、讨论分析 五、参考文献
一、目的意义
1、了解常见细菌种属的鉴定程序 2、掌握细菌的生理生化指标鉴定方法
二、材料方法
关键技术:
分类鉴定手册的使用 分类鉴定的标准流程 标准菌株参比
二、材料方法-基本原理
（一）微生物分类鉴定的方法—多相分类法 多相分类法：Colwell1970年提出，指利用微生物
（二）微生物的生理生化反应
1、淀粉水解实验 2、糖发酵试验 3、MR（甲基红） 4、V-P（伏-普）
1、淀粉水解实验 不同微生物对不同大分子的水解能
力不同，说明它们有着不同的酶系统。
淀粉遇到碘液会产生蓝色，但是细 菌水解淀粉的区域，用碘测试不再产生 蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
2、糖发酵试验
引物 名称
引物序列
扩增 长度
27F
1492R 357F: 1114R
5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-
3’
1475bp
5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3
5’-TACGGGAGGCAGCAG-3’ 757bp
5’-GCAACGAGCGCAACC:C-3’
二、步骤
细菌培养液 DNA提取
传统分类是认识微生物实际重要性和研究 生物进化的基础。
2、数值分类
是随着信息数字化时代的发展，根据微生 物分类学信息，应用计算数学原理和技术辅助 定义微生物分类单元的一种方法。
主要是向分类学家提供准确的、可重复的 、大信息量的处理手段。
3、化学分类
是研究微生物细胞不同化学特性，并利用 这些特性对生物个体进行分类和鉴定。
菌体、菌落、芽孢 革兰氏染色等 糖发酵 MR、VP
技术路线：
出发菌株 形态观察 分子鉴定（16S、ITS） 理化分析 化学分析 遗传分析 菌种鉴定
第一次实验：
讨论并设计实验方案； 实验材料准备：活化培养基、发酵培养基
等； 接种：LB斜面/平板，37℃培养16~24h
活化培养基
蛋白胨：10.0g； 酵母膏：5.0 g； 氯化钠：10.0g； 琼 脂：25g； 蒸馏水：1000ml pH到 7.0。
接种后，轻轻摇动试管使其混合均匀，防止倒置的小管进入气泡 将接过种的和作为对照的6支管均置于37℃培养24~48小时。 观察各试管颜色变化以及杜氏小管有无气泡。
4、MR、VP试验
配制蛋白胨水培养基，接种试验菌种。 培养48小时后，将一支葡萄糖蛋白胨水培养物中加入甲
基红试剂2滴，培养基若变为红色者，为阳性，变黄色 者为阴性。 取另外一支培养48小时后的葡萄糖蛋白胨水培养物，加 入5~10滴40%的KOH，然后加入等量的5%的a-萘酚溶 液，用力振荡，再放入37°温箱中保温15~30分钟，以 加快反应速度。培养物呈红色者，为V-P反应阳性。
多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育 的信息，综合研究微生物分类和系统进化的过程。多 相分类法几乎包括了现代分类中所有的方面，如传统 分类、化学分类、分子分类、数值分类等，被认为是 目前研究各级分类单元最有效的手段，可用于所有水 平上的分类单元的描述和定义。
1、传统分类法
也称描述分类，主要指以形态特征、培养 特பைடு நூலகம்以及生理生化特征等表观分类指征，对微 生物分类单元进行的描述分类。
-16S rDNA、23S rDNA、5S rDNA 三部分组成一个RNA 操纵 子, 这个操纵子作为一个单位进行转录。转录后处理成为成 熟的16S、23S 和5SrRNA。
2、为什选择16SrDNA?
-rRNA结构既具保守性又具高变性。保守性反映生物物种 的亲缘关系, 高变性则揭示生物物种的特征核酸序列, 是属 种鉴定的分子基础。
基因组DNA PCR扩增
阳性克隆鉴定
连接克隆载体
16S rDNA片段 片段回收
测序
序列比对
序列比对(blast)
1、将测序序列文件转换为FASTA形式
一般序列格式
序列比对(blast)
1、将测序序列文件转换为FASTA形式
FASTA格式
序列比对(blast)
1、利用NCBI (美国国国立生物技术信息中心 /） 进行序列比对
微生物学实验技术
一株产中性蛋白酶芽孢细菌的选育
山东农业大学生命科学学院 微生物学系
2013.09
实验内容
一、产中性蛋白酶芽孢细菌的初步筛选 二、产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种 三、产中性蛋白酶芽孢细菌的发酵复筛
四、产中性蛋白酶芽孢细菌的分类鉴定
五、产酶菌株生长曲线的测定 六、产酶菌株的菌种保藏
实验四 产中性蛋白酶芽孢菌的分类鉴定
用来检测由葡萄糖产生的有机酸， 如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产 酸时，甲基红试剂会由橘黄色（6.3）变 为红色（4.2），即为甲基红阳性反应。
4、V-P VP试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生
非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。
此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧 化成二乙酰。二乙酰与蛋白质中的精氨酸的胍 基作用，生成红色化合物，即为VP试验阳性。
-23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析 较困难。
3、16S rDNA的特点
-16S rRNA普遍存在于原核生物中；
-在 16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有 中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不 同的各类生物亲缘关系的研究
V1: 61-106bp V2: 121-240bp V3: 436-500bp V4: 588-671bp V5: 734-754bp
V6: 829-827bp V7: 990-1045bp V8: 1118-1160bp V9: 1240-1298bp V10: 1410-1492bp
5、常用的16SrDNA扩增引物
-16S rRNA的相对分子量大小适中，约1540 个核苷酸，便 于序列分析。
-可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所 以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来， 利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类 鉴定。
4、16S rDNA的序列组成
V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应 ，在肠道菌的鉴定上尤为重要。
绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源 ，但在分解糖类物质的能力上差别很大。有的能 产酸和气体，有的只产酸不产气。
发酵产酸时，溴甲酚紫（pH6.8）变为黄色 （pH5.2）。气体的产生可以由倒扣的杜氏小管 中有无气泡来证明。
3、MR（甲基红试验）
液，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板 观察菌落周围有没有透明圈出现。透明圈和菌落的直径大小可以
初步判断菌体解淀粉的活性。
2、糖发酵试验
用记号笔在装有糖发酵培养基的试管壁上分别表明培养基名称和 所接种的细菌菌名。
取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入大肠杆菌、枯草杆菌、 普通变形杆菌，对照不接种。另取乳糖发酵培养基试管3支，操 作同上。
五、参考文献（举例）
第二次实验：
（一）接种： 将活化好的菌种接种到鉴定培养基中 按照要求进行培养。 观察记录其菌落形态、菌体形态 革兰氏染色
第三次实验：
（一）完成菌种鉴定实验
理化指标（淀粉水解、糖发酵、MR、VP）
（二）菌种生长曲线试验准备
三、数据结果
四、讨论分析
分类鉴定的程序 分类鉴定指标的确定 ……
一、16S rDNA的特点
1、16S rDNA 与16S rRNA的关系
-16SrDNA 是编码原核生物核糖体RNA小亚基16SrRNA 的基 因，与细菌整个基因组的变化相比，它具有高度的保守性。
-细菌的rRNA 含量大，约占细菌总RNA量的80%，是组成细 菌核糖体的基本组成部分。编码rRNA 的基因是按5′-16S23S-5S-3′方式排列的, 由两个非编码的间隔区序列所分开。
由于细胞化学成分及分子结构的稳定性好 ，因此化学分类是原核微生物系统分类学的主 要方法之一。
3、化学分类的常用方法
细胞（壁）化学组分分析 枝菌酸分析（诺卡氏菌） 磷酸类脂分析 脂肪酸组分分析 醌组分分析 全细胞蛋白SDS-PAGE分析 核糖体蛋白双向凝胶电泳（2D-PAGE）
4、分子分类
从分子水平上，对生物个体的DNA、RNA和蛋白质进 行研究，并根据获得的基因型信息对生物个体进行分 类的方法。
DNA G+Ｃmol% DNA 分子指纹分析 DNA-DNA杂交 核酸序列分析（16srDNA、ITS等）
利用16S rDNA序列测序的方法 对细菌进行种属鉴定
内容
一、16S rDNA的特点 二、用于细菌种属鉴定的步骤
实验材料
1. 菌种 待鉴定菌株：分离物； 参比菌株：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等 2、培养基 3、仪器或其他用具
1. 淀粉水解试验
将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃，无菌操作制成平板。 用记号笔在平板底步划成三部分，将枯草、大肠杆菌、变形杆菌
等分别划线接种，并在平板背面标注菌种名称。 37 ℃倒置培养24-48小时 观察各种细菌的生长情况。将平板打开盖子，滴入少量Lugol’s碘
一、目的意义 二、材料方法 三、数据结果 四、讨论分析 五、参考文献
一、目的意义
1、了解常见细菌种属的鉴定程序 2、掌握细菌的生理生化指标鉴定方法
二、材料方法
关键技术:
分类鉴定手册的使用 分类鉴定的标准流程 标准菌株参比
二、材料方法-基本原理
（一）微生物分类鉴定的方法—多相分类法 多相分类法：Colwell1970年提出，指利用微生物
（二）微生物的生理生化反应
1、淀粉水解实验 2、糖发酵试验 3、MR（甲基红） 4、V-P（伏-普）
1、淀粉水解实验 不同微生物对不同大分子的水解能
力不同，说明它们有着不同的酶系统。
淀粉遇到碘液会产生蓝色，但是细 菌水解淀粉的区域，用碘测试不再产生 蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
2、糖发酵试验
引物 名称
引物序列
扩增 长度
27F
1492R 357F: 1114R
5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-
3’
1475bp
5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3
5’-TACGGGAGGCAGCAG-3’ 757bp
5’-GCAACGAGCGCAACC:C-3’
二、步骤
细菌培养液 DNA提取
传统分类是认识微生物实际重要性和研究 生物进化的基础。
2、数值分类
是随着信息数字化时代的发展，根据微生 物分类学信息，应用计算数学原理和技术辅助 定义微生物分类单元的一种方法。
主要是向分类学家提供准确的、可重复的 、大信息量的处理手段。
3、化学分类
是研究微生物细胞不同化学特性，并利用 这些特性对生物个体进行分类和鉴定。
菌体、菌落、芽孢 革兰氏染色等 糖发酵 MR、VP
技术路线：
出发菌株 形态观察 分子鉴定（16S、ITS） 理化分析 化学分析 遗传分析 菌种鉴定
第一次实验：
讨论并设计实验方案； 实验材料准备：活化培养基、发酵培养基
等； 接种：LB斜面/平板，37℃培养16~24h
活化培养基
蛋白胨：10.0g； 酵母膏：5.0 g； 氯化钠：10.0g； 琼 脂：25g； 蒸馏水：1000ml pH到 7.0。
接种后，轻轻摇动试管使其混合均匀，防止倒置的小管进入气泡 将接过种的和作为对照的6支管均置于37℃培养24~48小时。 观察各试管颜色变化以及杜氏小管有无气泡。
4、MR、VP试验
配制蛋白胨水培养基，接种试验菌种。 培养48小时后，将一支葡萄糖蛋白胨水培养物中加入甲
基红试剂2滴，培养基若变为红色者，为阳性，变黄色 者为阴性。 取另外一支培养48小时后的葡萄糖蛋白胨水培养物，加 入5~10滴40%的KOH，然后加入等量的5%的a-萘酚溶 液，用力振荡，再放入37°温箱中保温15~30分钟，以 加快反应速度。培养物呈红色者，为V-P反应阳性。
多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育 的信息，综合研究微生物分类和系统进化的过程。多 相分类法几乎包括了现代分类中所有的方面，如传统 分类、化学分类、分子分类、数值分类等，被认为是 目前研究各级分类单元最有效的手段，可用于所有水 平上的分类单元的描述和定义。
1、传统分类法
也称描述分类，主要指以形态特征、培养 特பைடு நூலகம்以及生理生化特征等表观分类指征，对微 生物分类单元进行的描述分类。
-16S rDNA、23S rDNA、5S rDNA 三部分组成一个RNA 操纵 子, 这个操纵子作为一个单位进行转录。转录后处理成为成 熟的16S、23S 和5SrRNA。
2、为什选择16SrDNA?
-rRNA结构既具保守性又具高变性。保守性反映生物物种 的亲缘关系, 高变性则揭示生物物种的特征核酸序列, 是属 种鉴定的分子基础。
基因组DNA PCR扩增
阳性克隆鉴定
连接克隆载体
16S rDNA片段 片段回收
测序
序列比对
序列比对(blast)
1、将测序序列文件转换为FASTA形式
一般序列格式
序列比对(blast)
1、将测序序列文件转换为FASTA形式
FASTA格式
序列比对(blast)
1、利用NCBI (美国国国立生物技术信息中心 /） 进行序列比对
微生物学实验技术
一株产中性蛋白酶芽孢细菌的选育
山东农业大学生命科学学院 微生物学系
2013.09
实验内容
一、产中性蛋白酶芽孢细菌的初步筛选 二、产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种 三、产中性蛋白酶芽孢细菌的发酵复筛
四、产中性蛋白酶芽孢细菌的分类鉴定
五、产酶菌株生长曲线的测定 六、产酶菌株的菌种保藏
实验四 产中性蛋白酶芽孢菌的分类鉴定
用来检测由葡萄糖产生的有机酸， 如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产 酸时，甲基红试剂会由橘黄色（6.3）变 为红色（4.2），即为甲基红阳性反应。
4、V-P VP试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生
非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。
此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧 化成二乙酰。二乙酰与蛋白质中的精氨酸的胍 基作用，生成红色化合物，即为VP试验阳性。