蛋白质分析r

紫外法应用：
导数法用于蛋白质的定性和定量分析 蛋白质结构及构型的研究
荧光光谱法
激发280nm，发射340-350nm；一般定量外，主要用于蛋白质结构与构型的研究
化学方法(1)

凯氏(kjeldahl)定氮法
原理：所有的含氮化合物在浓硫酸和催化剂（通常为铜离子）的存在 下加热转化为氨，氨与硫酸作用生成硫酸铵而稳定存在于溶液中。蛋白 质中氮的含量一般是16%。
侧链的构型等。
蛋白质二级 结构模式图
a 螺旋
每圈螺旋占3.6个氨基酸 残基,沿螺旋轴上升0.54nm, 螺旋直径约0.5nm(不计侧 链),相邻螺旋间形成氢键(其 取向几与螺旋轴平行),氢键 是由肽基的C=O与前面第三 个肽基的N-H之间形成的。 由氢键封闭的环是13元环:
故a-螺旋也称 3.613-螺旋
Edman 化学降解法(4):Chromatography

RP-HPLC
酶降解法

肽链外切酶(外肽酶)
氨肽酶，羧肽酶
质谱法

基质辅助激光解吸/电 离质谱(MALDI-MS)
电喷雾离子化质谱仪
肽段在多肽链中次序的决定
二硫桥位置的确定
胃蛋白酶水解 对角线电泳：

引起变性的因素：
热变性 酸和碱变性 尿素和盐酸胍变性 表面活性剂变性 其它因素：有机溶剂、盐、超声波、X射线
蛋白质分析方法
光谱法
紫外光谱法， 荧光光谱法
化学方法
凯氏（Kiedahl）定氮法 双缩脲法(Biuret Assay)，劳里（Lowry）法
染料结合法
甲基橙(Methyl Orange)法 考马氏亮蓝G-250(Coomassie Brillant Blue, CBB)法 溴甲酚绿（Bromocresol Green） 溴甲酚紫（Bromocresol Purple）法

方法
0.5ml 蛋白质溶液 4.5ml 试剂 混合反应30min 545nm 吸收测量

校准
用标准蛋白质0.5-20.0 g l-1做标准曲线
化学方法（３）

劳里（Lowry)法
原理：Folin（磷钼酸盐－磷钨酸盐）试剂，检测酚基（蛋白质中的酪氨 酸残基）。Folin试剂(磷钼酸盐－磷钨酸盐)与铜离子结合时其灵敏度可 大大提高。低浓度的双缩脲试剂与蛋白质形成的Cu2+-蛋白质络合物可以 还原Folin试剂的主要成分磷钼酸盐－磷钨酸盐到钼蓝和钨蓝。 测量：７５０nm (600~800nm)
CBB法定量蛋白质示例
CBB
考马氏亮蓝G-250 乙醇 47.0 ml l-1 磷酸 85.0 g l-1


试剂
0.1 g l-1
方法
0.1 ml 蛋白质样品 5.0 ml 试剂 混合 595 nm 光度测量

校准
用0.1~2.0 gl-1标准蛋白质溶液做标准曲线
CBB G-250（左）及溴甲酚绿（右）结合蛋白质前 （A)后(B)的吸收光谱
蛋白质分析
对象
蛋白质总量的测定 针对特定蛋白质的测定
意义
基础科学研究 食品的鉴定与评价 评价健康状况、诊断疾病
内容
蛋白质的定量分析 构型或结构研究 蛋白质的氨基酸序列的测定
蛋白质的分类及结构
蛋白质的组成单位—氨基酸
多肽的结构
酰胺键（肽键）的特点
酰胺氮上的孤对电子与相邻的羰基氧之间的共振相互作用，使 肽单元具有一定的稳定性，表现在Ｃ－Ｎ键不能绕键轴自由旋转， 使肽单元上的四个原子处在一个平面。这种平面结构在肽链折叠成 三维构型的过程中有重要作用
分离及生物分析法

电泳
SDS-PAGE 非变性－PAGE 等电聚焦

色谱
空间排阻 离子交换 亲和色谱
蛋白质一级结构的测定
蛋白质测序的策略


测定蛋白质中多肽链的数目 拆分蛋白质分子的多肽链 断开多肽链内的二硫桥 分析每一个多肽链的氨基酸组成 鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基 裂解多肽链成较小的片段 测定各肽段的氨基酸序列 重建完整多肽链的一级结构 确定半胱氨酸残基间形成S-S交联桥的位置
评价: 优点：灵敏度高(比双缩脲法高100倍)。 缺点：费事，干扰物质多，酪氨酸含量差异的影响大。
劳里法定量蛋白质示例

试剂
1.碱性铜试剂 20mg l-1硫酸铜，20mg l-1酒石酸钾钠， 20 g l-1碳酸钠，40 g l-1氢氧化钠 2.磷钼酸盐－磷钨酸盐

方法
6.0ml碱性铜试剂 0.5ml蛋白质溶液 混合反应10 min 加0.5ml磷钼酸盐－磷钨酸盐混合反应30min 600nm处光度测量
蛋白质按生物学功能分类
蛋白质的一、二级结构

一级结构(primary structure):
肽链中氨基酸的序列以及二硫桥的位置。

二级结构(Secondary structure):
一条多肽链或链的一部分依靠氢键维持的局部有规则的构型称为二级
结构。(肽链的主链在空间的排列)
α －螺旋(α -Helix)、β －折叠(β -Pleated Sheet)、β －转角(β -Corner) 等。二级结构还包括无规则卷曲（Random wind）以及非氢键维系的规则结构和
溴甲酚绿及溴甲酚紫
溴甲酚绿
溴甲酚紫
溴甲酚紫定量白蛋白示例
试剂
溴甲酚紫 40μmol l-1 醋酸缓冲液 pH 5.2


0.1 mol l-1
方法
5.0ml染料试剂 0.02ml蛋白质溶液 混合反应10 min 603 nm光度测量

校准
用0.1~2.0 g l-1白蛋白质标准溶液做校准曲线
染料结合法（4）
多肽与蛋白质的区别
分子量大小，6-30个氨基酸残基数，5000; 构型，结构α-螺旋结构
蛋白质的分类
蛋白质的种类： 1010-1012
蛋白质的分子量：6×103~1×106 蛋白质的分类：
简单蛋白： 白蛋白 球蛋白 组蛋白 精蛋白 谷蛋白 醇溶谷蛋白 硬蛋白 结合蛋白： 糖蛋白 核蛋白 脂蛋白 磷蛋白 金属蛋白 血红素蛋白 黄素蛋白
Edman 化学降解法 (1): Coupling
生成苯氨基硫代甲酰基(PTC)衍生物
Edman 化学降解法(2):Cleavage
反应条件:45~55℃ 无水有机酸(三氟乙酸或七氟丁酸); 产物:苯胺基噻唑啉酮, ATZ;萃取分离
Edman 化学降解法(3):Conversion
反应条件:60 ℃,含水酸; 产物:苯乙内酰硫脲(PTH)衍生物。

荧光染料法
原理：荧光染料与蛋白质结合后，由于荧光染料所处的微环境发生变化 ，使其荧光量子产率及波长可发生很大的变化。 1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)：ANS在水溶液中荧光量子产率为0.004,荧光 发射波长515 nm, 结合血红蛋白后，荧光量子产率和发射波长分别为 0.98和454nm。 荧光胺：在pH 8的磷酸钠缓冲溶液中，荧光胺与蛋白质中的赖氨酸残基 作用，荧光发射波长为475 nm。
Doumas配方：硫酸铜，酒石酸钾钠和氢氧化钠
评价：双缩脲法是较通用的测量蛋白质总量的方法。
优点：操作简单快速，适用于自动分析仪。 缺点：灵敏度低（约1mg/ml），测定范围1~10mg/ml。
双缩脲反应
双缩脲反应定量蛋白质示例

试剂
硫酸铜 1.5 gl-1 酒石酸钾钠 6.0 gl-1 氢氧化钠 30.0 gl-1
寡聚蛋白质中不同种类和数目的亚基在空间的排布及亚基之间的相互作用。 均一四级结构，非均一四级结构。 维持四级结构的作用力主要是疏水作用力。．

蛋白质构象
蛋白质构象
蛋白质的变性

定义：
天然蛋白质分子在外界因素的作用下，由紧密有序的结构变成松散 无序的结构，并使蛋白质的物理化学性质及生物活性发生变化的现象。 （变性一般只涉及次级键，二硫键的断裂，不涉及一级结构的变化）
染料结合法（３）

溴甲酚绿 (Bromocresol Green) 溴甲酚紫 (Bromocresol Purple)法
原理：在pH4.2时，溴甲酚绿可选择性和白蛋白结合，使染料在630nm处 吸收大大加强，据此可对白蛋白进行定量分析。 评价：最低检出限 50 μg/ml，在该pH时，复合物易沉淀，不同来源白蛋白 吸光度有差异。 溴甲酚紫：对白蛋白特异性提高，不同来源白蛋白差异减少。pH 5.2，最 大吸收603nm。
评价：常用于动植物食品中蛋白质含量的测定。 其它含氮化合物被同时测定,方法较复杂、费时。
凯氏(kjeldahl)定氮法(2)
化学方法(2)

双缩脲法(Biuret Assay)
配位，形成紫色络合物．蛋白质分析中，亲核基团由肽键提供。 最大吸收：330 nm, 545 nm
原理：在碱性硫酸铜溶液中，铜离子与四个分子的双缩脲中的亲核氮原子
(2)还原法: 硼氢化锂还原至相应的a-氨基醇 (3)羧肽酶法
多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化

酶裂解法

化学裂解法
化学裂解法
羟胺 (NH2OH)断裂法
溴化氰断裂法
反应条件: pH 9.0; 作用位置:Asn-Gly
反应条件: 70%甲酸; 作用位置:甲硫氨酸
肽段氨基酸序列的测定
Edman 化学降解法 酶降解法 质谱法 根据核苷酸序列的推定法
原理：在pH3.5缓冲溶液中，白蛋白与甲基橙的亲和性比其它蛋白质的 亲和性强，染料与蛋白质结合所形成的络合物在550nm处的光吸收减少 评价：该方法不适合用作一般蛋白质含量的测定
染料结合法（２）

考马氏亮蓝G-250(Coomassie Brillant Blue, CBB)法
原理：在酸性条件下（1.46 mol/L H3PO4介质)，CBB的颜色为浅红 色，最大吸收波长在464和595 nm，但在与蛋白质反应后生成深蓝色 的复合物，在595nm处的光吸收强度大大加强。 评价：反应快(2~5 min)，灵敏度高(1~20μg/ml )，比劳里法约高４ 倍，干扰较少。 CBB与蛋白质的结合似乎与碱性氨基酸有关，要求做工作曲 线的标准蛋白与待测蛋白是同一种.
极性特点: 疏水的内核，亲水的表面。 维持蛋白质三级结构的各种作用力：
疏水作用、氢键、范德华力、 离子键、二硫键及配位键。
蛋白质的四级结构

蛋白质亚基
分子量较大的蛋白质分子由多条肽链组成，这些具有球形三维结构的多肽链称为蛋白质 亚基。

寡聚蛋白及多聚蛋白 蛋白质四级结构(Quaternary structure)
二硫桥的断裂

过甲酸氧化法和巯基化合物还原法
pH 8~9, 室温数小时, 8M尿素或6M盐酸胍
氨基酸组成的分析
酸水解:
反应条件：6 mol/L HCl 110℃真空或氮气保护， 10~24 h。 色氨酸被破坏。
碱水解:
反应条件：5 mol/L NaOH 110℃真空或氮气保护， 20h。 色氨酸可定量回收。

校准
用0.1~2.0gl-1标准蛋白质溶液的做校准曲线
劳里法的改进（1985)
紫色络合物，５６２nm测量，试剂（４－甲酸喹啉） 比Folin试剂稳定，干扰物质减少
BCA 法，bicinchoninic acid (二辛可酸)， 2,2-联喹 啉-4,4-二甲酸二钠
染料结合法（１）

甲基橙（Methyl Orange)法：
氨基酸分析仪分析
N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定(1)

N-末端分析
(1)二硝基氟苯(DNFB或FDNB)法 (2)丹磺酰氯(DNS ) (3)苯异硫氰酸酯(PITC)法 (4)氨肽酶法
N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定(2)

源自文库
C-末端分析
(1)肼解法
产物氨基酸酰肼可与苯甲醛作用变成二苯基衍生物沉淀， 游离c-氨基酸用DNFB 或DNS法及层析技术鉴定
分离及生物分析法
紫外光谱法
紫外光谱法（２）
经验公式：

Lowry-Kalckar公式：蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280-0.74A260 Warburg-Christian公式: 蛋白质浓度(mg/ml)=1.55A280-0.76A260 适用浓度范围 0.1-0.5mg/ml
对较稀的溶液可以根据215nm、225nm处吸光度的差来测定蛋 白质浓度(20-100μg/ml浓度范围内服从朗贝比尔定律)；紫外光谱法 只适用于可溶性蛋白
β －折叠
两条或多条几乎完 全伸展的多肽链侧向 聚集, 相邻肽链主链上 的-NH和C=O之间形 成有规则的氢键。 β －折叠分平行式(肽链 的N末端都在同一方向 )和反平行式(相邻肽链 是反向的)。
蛋白质的三级结构
三级结构(tertiary structure):
肽链通过盘旋或折叠形成紧密的借各种次级键维持的球状结构。