第六章 化学发光免疫分析 (2)
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1.单克隆抗体包被磁性微粒L微粒直径＜7μ 2.抗原抗体结合 3.洗涤、分离 4. 底物AMPPD发光剂
四、电化学发光免疫分析
技术类型
❖ 1．分离方法 磁颗粒分离技术。 ❖ 2．免疫学反应模式 其反应模式与酶发光免
疫测定技术相同，所不同的只是相应标记抗 原或抗体上标记的是三联吡啶钌而不是酶。
（二）测定方法
三、以能量传递参与氧化反应的非酶 标记物
❖ 这类标记物作为 化学发光反应的 催化剂或能量传 递过程中的中间 体(或受体)，不 直接参与化学发 光反应。最常用 的有三联吡啶钌 标记物。
第三节 化学发光免疫分析的类型
根据发光免疫分析中所采用的发光反 应的体系不同和标记物不同，可将发光 免疫分析分为： ❖ 化学发光免疫分析 ❖ 化学发光酶免疫分析 ❖ 微粒子化学发光免疫分析 ❖ 电化学发光免疫分析
第六章 化学发光免疫分析
❖ 化学发光免疫分析是目前发展和推广应
用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的 标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免 法、荧光法高几个数量级，可以完全替代放 射免疫分析、彻底淘汰酶联免疫分析。主要 具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、 试剂稳定且有效期长（6～18个月）、方法稳 定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度 高等优点。
技术类型
❖ 1.分离方法 磁颗粒分离技术。 ❖ 2.免疫学反应模式 常用的是双抗体夹心法，
尚有竞争性结合法和抗体探测分析法，用以 测定不同类型的小分子物质。
技术要点
❖ 以碱性磷酸酶标记抗原或抗体、以磁性微粒子为固相 载体,用AMPPD(Diomums)作为化学发光剂，这种化 学发光剂发光稳定、持续时间长,因此比闪烁发光容 易控制。其测定原理和过程简述如下：
❖ 鲁米诺(1uminol)、异鲁米诺(isoluminol)及其 衍生物是最早在CLIA中使用的一种常用的化 学发光物质。
（二）碱性磷酸酶
❖ 碱性磷酸酶（ALP）分子量小、稳定性好、活性高、 易分离提纯，已广泛用于酶联免疫分析和核酸杂交 分析的标记物。
❖ AMPPD是一种超灵敏的ALP底物，性质十分稳定。 AMPPD的发光机制如图6-4所示。
在该类分析中，化学发光强度取决于抗原-抗体结 合的量，抗原-抗体复合物越多，参与催化反应的酶 越多，发光信号越强。
❖ 技术类型
1.根据酶促反应底物不同分类 可分为荧光酶免疫测
定技术和化学酶免疫测定技术。
2．根据免疫学反应模式分类 （1）双抗体夹心法 （2）双抗原夹心法 （3）固相抗原竞争法
三、微粒子化学发光免疫分析
❖ 由体系中的反应物发生化学反应后直接生成激发态 的产物，即直接发光；
A+B→C*→C+光辐射
❖ 由体系内存在的易于接受能量的荧光物质，获得化 学反应释放的能量后转变为激发态，即间接发光。
A+B→C*→F→F*→F+光辐射
（二）化学发光的条件和类型
❖ 化学发光的条件
（1）足量的激发能 （2）合适的反应过程 （3）化学发光量子效率
❖化学发光的类型 根据化学发光反应的发光时间
长短情况，可以将化学发光分为
❖ 闪光型（flash type） 该型发光时间很短，只 有零点几秒到几秒。
❖ 辉光型（glow type） 该型发光时间从几分钟 到几十分钟或几小时甚至更久。
二、免疫反应系统
❖ 免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激
发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化 学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析)
概述
❖ 化学发光免疫分析（Chemiluminescence immunoassay, CLIA）是将化学发光技术与免 疫反应系统相结合，用以检测各种抗原、半 抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和 药物等的检测分析技术。
❖ 该法以化学发光物质为示踪物，具有简便、 快速、重复性好，无放射性污染的特点
技术，所不同的只是相应标记抗原或抗 体上标记的是吖啶酯而不酶
二、化学发光酶免疫分析
❖ 化学发光酶免疫分析（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA）以催化反应参与发光的酶 作为标记物，标记抗体或抗原。待测样本与检测试 剂进行免疫反应后，形成的酶标记抗原-抗体复合物。 其结合在复合物上的酶对鲁米诺-过氧化氢体发光底 物体系发生催化作用，产生发光效应，测定发光强 度信号可分析被测抗原或抗体的含量(图6-7)。
一、化学发光免疫分析
❖ 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体，与待测标本 中相应抗体或抗原、磁颗粒性的抗原或抗体反应， 通过磁场把结合状态和游离状态的化学发光剂标记 物分离开来，然后加入发光促进剂进行发光反应， 通过对发光强度的检测进行定性或定量检测。
技术类型
1．分离方法 常用磁颗粒分离技术。 2．免疫学反应模式 同酶发光免疫测定
上，或酶作用于发光底物。
第二节 化学发光免疫分析中的标记物
❖ 根据其参与的化学反应不同，可分为三类：
❖ 一是发光免疫分析反应中直接参与发光反应的标记 物；
❖ 二是以催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记 物；
❖ 三是以能量传递参与氧化反应非酶记物。
一、直接参与发光反应的标记物
❖ 通常这类物质没有本底发光，在反应中能用于检测 低浓度或微量浓度的样品。其中研究得较多的是吖 啶酯类化合物。
第一节 化学发光免疫分析技术的原理
化学发光免疫分析系统包含：
化学发光分析系统和免疫反应系
两个部分。
一、化学发光分析系统
❖ 一种物质由电子激发态回 复到基态时，释放出的能 量表现为光的发射，称为 发光（luminescence）。
（一）直接发光与间接发光
❖ 根据化学发光激发态物质产生的方式可以将 化学发光反应分为两类：
二、 以催化反应或能量传递参与发光 的酶标记物
❖ 这类发光反应中，采用某些酶作为标记物， 这类标记物作为发光反应的催化剂或作为一 种能量传递过程中的受体，其本身又直接参 与发光反应。
（一）辣根过氧化物酶
❖ 辣根过氧化物酶（HRP）是应用最广泛的酶 之一，它可以与H202催化氧化许多电子给予 体的底物。
电化学发光反应模式(以双抗体夹心法为例):
1.首先将特异性抗体包被在磁性微珠上，另外将发光剂 [Ru(bpy)3]2+标记在特异性抗体上。
四、电化学发光免疫分析
技术类型
❖ 1．分离方法 磁颗粒分离技术。 ❖ 2．免疫学反应模式 其反应模式与酶发光免
疫测定技术相同，所不同的只是相应标记抗 原或抗体上标记的是三联吡啶钌而不是酶。
（二）测定方法
三、以能量传递参与氧化反应的非酶 标记物
❖ 这类标记物作为 化学发光反应的 催化剂或能量传 递过程中的中间 体(或受体)，不 直接参与化学发 光反应。最常用 的有三联吡啶钌 标记物。
第三节 化学发光免疫分析的类型
根据发光免疫分析中所采用的发光反 应的体系不同和标记物不同，可将发光 免疫分析分为： ❖ 化学发光免疫分析 ❖ 化学发光酶免疫分析 ❖ 微粒子化学发光免疫分析 ❖ 电化学发光免疫分析
第六章 化学发光免疫分析
❖ 化学发光免疫分析是目前发展和推广应
用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的 标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免 法、荧光法高几个数量级，可以完全替代放 射免疫分析、彻底淘汰酶联免疫分析。主要 具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、 试剂稳定且有效期长（6～18个月）、方法稳 定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度 高等优点。
技术类型
❖ 1.分离方法 磁颗粒分离技术。 ❖ 2.免疫学反应模式 常用的是双抗体夹心法，
尚有竞争性结合法和抗体探测分析法，用以 测定不同类型的小分子物质。
技术要点
❖ 以碱性磷酸酶标记抗原或抗体、以磁性微粒子为固相 载体,用AMPPD(Diomums)作为化学发光剂，这种化 学发光剂发光稳定、持续时间长,因此比闪烁发光容 易控制。其测定原理和过程简述如下：
❖ 鲁米诺(1uminol)、异鲁米诺(isoluminol)及其 衍生物是最早在CLIA中使用的一种常用的化 学发光物质。
（二）碱性磷酸酶
❖ 碱性磷酸酶（ALP）分子量小、稳定性好、活性高、 易分离提纯，已广泛用于酶联免疫分析和核酸杂交 分析的标记物。
❖ AMPPD是一种超灵敏的ALP底物，性质十分稳定。 AMPPD的发光机制如图6-4所示。
在该类分析中，化学发光强度取决于抗原-抗体结 合的量，抗原-抗体复合物越多，参与催化反应的酶 越多，发光信号越强。
❖ 技术类型
1.根据酶促反应底物不同分类 可分为荧光酶免疫测
定技术和化学酶免疫测定技术。
2．根据免疫学反应模式分类 （1）双抗体夹心法 （2）双抗原夹心法 （3）固相抗原竞争法
三、微粒子化学发光免疫分析
❖ 由体系中的反应物发生化学反应后直接生成激发态 的产物，即直接发光；
A+B→C*→C+光辐射
❖ 由体系内存在的易于接受能量的荧光物质，获得化 学反应释放的能量后转变为激发态，即间接发光。
A+B→C*→F→F*→F+光辐射
（二）化学发光的条件和类型
❖ 化学发光的条件
（1）足量的激发能 （2）合适的反应过程 （3）化学发光量子效率
❖化学发光的类型 根据化学发光反应的发光时间
长短情况，可以将化学发光分为
❖ 闪光型（flash type） 该型发光时间很短，只 有零点几秒到几秒。
❖ 辉光型（glow type） 该型发光时间从几分钟 到几十分钟或几小时甚至更久。
二、免疫反应系统
❖ 免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激
发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化 学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析)
概述
❖ 化学发光免疫分析（Chemiluminescence immunoassay, CLIA）是将化学发光技术与免 疫反应系统相结合，用以检测各种抗原、半 抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和 药物等的检测分析技术。
❖ 该法以化学发光物质为示踪物，具有简便、 快速、重复性好，无放射性污染的特点
技术，所不同的只是相应标记抗原或抗 体上标记的是吖啶酯而不酶
二、化学发光酶免疫分析
❖ 化学发光酶免疫分析（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA）以催化反应参与发光的酶 作为标记物，标记抗体或抗原。待测样本与检测试 剂进行免疫反应后，形成的酶标记抗原-抗体复合物。 其结合在复合物上的酶对鲁米诺-过氧化氢体发光底 物体系发生催化作用，产生发光效应，测定发光强 度信号可分析被测抗原或抗体的含量(图6-7)。
一、化学发光免疫分析
❖ 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体，与待测标本 中相应抗体或抗原、磁颗粒性的抗原或抗体反应， 通过磁场把结合状态和游离状态的化学发光剂标记 物分离开来，然后加入发光促进剂进行发光反应， 通过对发光强度的检测进行定性或定量检测。
技术类型
1．分离方法 常用磁颗粒分离技术。 2．免疫学反应模式 同酶发光免疫测定
上，或酶作用于发光底物。
第二节 化学发光免疫分析中的标记物
❖ 根据其参与的化学反应不同，可分为三类：
❖ 一是发光免疫分析反应中直接参与发光反应的标记 物；
❖ 二是以催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记 物；
❖ 三是以能量传递参与氧化反应非酶记物。
一、直接参与发光反应的标记物
❖ 通常这类物质没有本底发光，在反应中能用于检测 低浓度或微量浓度的样品。其中研究得较多的是吖 啶酯类化合物。
第一节 化学发光免疫分析技术的原理
化学发光免疫分析系统包含：
化学发光分析系统和免疫反应系
两个部分。
一、化学发光分析系统
❖ 一种物质由电子激发态回 复到基态时，释放出的能 量表现为光的发射，称为 发光（luminescence）。
（一）直接发光与间接发光
❖ 根据化学发光激发态物质产生的方式可以将 化学发光反应分为两类：
二、 以催化反应或能量传递参与发光 的酶标记物
❖ 这类发光反应中，采用某些酶作为标记物， 这类标记物作为发光反应的催化剂或作为一 种能量传递过程中的受体，其本身又直接参 与发光反应。
（一）辣根过氧化物酶
❖ 辣根过氧化物酶（HRP）是应用最广泛的酶 之一，它可以与H202催化氧化许多电子给予 体的底物。
电化学发光反应模式(以双抗体夹心法为例):
1.首先将特异性抗体包被在磁性微珠上，另外将发光剂 [Ru(bpy)3]2+标记在特异性抗体上。