13应生张寿丽-实验二-光合色素的提取、理化性质-、-分离、吸收光谱及含量的测定

专业：应用生物科学班级：13应生姓名：张寿丽学号：134120258

实验二、光合色素的提取、理化性质、

分离、吸收光谱及含量的测定

一、实验目的：

1、掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。

2、掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。

3、掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。

二、实验原理：

1、光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。

2、提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。

3、离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。

4、叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。

5、叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+、Zn2+

等离子所取代。

6、不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对

它们的吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。

7、叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝紫光。

8、混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重

叠，仍然可以根据Lambert-Beer定律（A = k L C）求出各组分含量。Lambert定律：A = k L；Beer定律A = k C。叶绿素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分别为663nm、645nm，由此得出：见推导过程

Ca = 12.7 A663 –2.69 A645；Cb = 22.9 A645 – 4.68 A663 Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A645

9、A663 = Ca.ka1 + Cb.kb1

A645 = Cb.kb2 + Ca.ka2

分光光度计测出，故求二元一次方程组可得到此公式。

10、k——比吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓

度(C)为1g/L(0.1%)，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为比吸收系数。

11、ε——摩尔吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的

浓度(C)为1mol/L，比色皿的直径(光径，L)为1cm时所测出的吸光度即为摩尔吸收系数。

三、实验药品及仪器：

（一）、材料：

叶子花的叶片。

（二）、药品：

碳酸钙、石英砂、丙酮、30%KOH甲醇溶液、苯、50%醋酸、醋酸铜、80%丙酮、石油醚。

（三）、仪器：

解剖剪、滤纸、漏斗、吸量管、试管，三角瓶、洗耳球、离心管、研钵、酒精灯、分光光度计、便携式叶绿素测定仪、离心机、试管夹、试管架。

四、方法及步骤：

（一）、光合色素的提取：

将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/2片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml 丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。

1、荧光现象：与光线垂直的方向观察色素颜色。

2、光破坏作用：1ml色素提取液于室内，1ml于太阳光下，30min

后观察颜色变化。

3、皂化反应：取一支试管，加入色素提取液2.5ml，再加入30%KOH 甲醇溶液1ml，摇匀，再加入苯2.5ml，轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水1ml，轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的变化。

4、取代反应：取一支试管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶液变为黄褐色。倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯上加热，与另一半比较颜色的差异。

（二）、光合色素的分离和吸收光谱：

1、光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/3片叶片，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。

2、光合色素分离：剪取适当长度和宽度的滤纸条→用上行纸层

析法分离色素→启动剂：石油醚：丙酮：苯=10：2：1。

3、吸收光谱的测定：

（1）、光合色素的吸收光谱：取色素溶液1 mL，加入丙酮3 mL，摇匀后在分光光度计上400到700 nm处每隔10 nm进行扫描。（2）、各色素的吸收光谱：上述层析出的3~4种色素，分别剪下后溶于3 mL丙酮中，按上述方法扫描。

（三）、光合色素含量的测定：

1、快速测定法：由于叶绿素a、b在652nm处有共同吸收，k =

34.5 L g-1. cm-1。可直接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶

片的叶绿素含量，最后浓度单位为mg/dm2

2、分光光度计法：色素提取：将上述植物叶片洗净并用滤纸吸

干，准确称取已知Φ的叶圆片0.05g，加入少许CaCO3和石英

砂及80%丙酮2ml，充分研磨，转入离心管中（离心机使用），

再用5ml 80%丙酮洗研钵，转入离心管中，平衡，5000rpm离心

10min, 记录上清液体积，取1ml稀释到4ml。

测定：以1cm比色皿分别测定A663、A645。使A控制在0.1 ~ 0.8

之间。

五、结果及分析：

（一）、光合色素的提取及其理化性质：

1、荧光现象：色素提取液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色。

分析：当叶绿素分子吸收收光子以后就由最稳定、最低能量的基态

上升到一个不稳定的、高能状态的激发态，激发态及其不稳定，停

留时间一般不超过几纳秒就迅速向较低能状态转变，转变的途径有

将光能转变为热能、光能及经激发态的叶绿素将光能传递给附近的

其它分子等三个途径，荧光现象即由转变为光能的途径中转变为荧

光的途径引起，仅占三条去路中的0.5%。

2、光破坏现象：色素提取液在阳光照射30min后由绿色变为褐

色。

分析：离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结

构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物，该产物呈褐色，故叶绿素

提取液变为了褐色。

3、皂化反应：在色素提取液中加入30%KOH甲醇后溶液由绿色变

为灰绿色；再加入苯以后分为上黄绿，中浅绿，下深绿三层；

加入水震荡后变为上层黄绿下层深绿两层。

分析：叶绿素分子是一种羧酸脂，能发生皂化反应。

4、取代反应：加入硫酸铜粉末并在酒精灯上加热的溶液由黄色变为绿色。