电子显微镜生物样品的制备实验

电子显微镜生物样品的制备实验

一、目的要求

学习并掌握制备微生物及核酸电镜样品的基本方法。

二、电子显微镜与光学显微镜的主要区别

显微镜的分辨率取决于所用光的波长，1933年开始出现的电子显微镜正是由于使用了波长比可见光短得多的电子束作为光源，使其所能达到的分辨率较光学显微镜大大提高。而光源的不同，也决定了电子显微镜与光学显微镜的一系列差异（表Ⅲ-1）。表Ⅲ-1

根据电子束作用于样品的方式的不同及成像原理的差异，现代电子显微镜已发展形成了许多种类型，目前最常用的是透射电子显微镜（transmission electron microscope）和扫描电子显微镜(scanning electron microscope)，前者总放大倍数可在1000~1000000倍范围内变化，后者总放大倍数可在20~300000倍之间变化。本实验主要介绍这两种显微镜样品的制备。

三、器材

1.菌种大肠杆菌（大肠埃希氏菌，Escherichia coli）斜面。

2.溶液或试剂醋酸戊脂，浓硫酸，无水乙醇，无菌水，2%磷钨酸钠（pH6.5~8.0）水溶液，0.3%聚乙烯甲醛（溶于三氯甲烷）溶液，细胞色素c，醋酸铵，质粒pBR322。

3.仪器或其他用具普通光学显微镜，铜网，瓷漏斗，烧杯，平皿，无菌滴管，无菌镊子，大头针，载玻片，细菌计数板，真空镀膜机，临界点干燥仪等。

四、操作步骤

（二）扫描电镜微生物样品的制备及观察

扫描电镜观察时要求样品必需干燥，并且表面能够导电。因此，在进行扫描电镜微生物样品制备时一般都需采用固定、脱水、干燥及表面镀金等处理步骤。

1.固定及脱水

生物样品的精细结构易遭破坏，因此在进行制样处理和进行电镜观察前必需进行固定，以使其能最大限度地保持其生活时的形态。而采用水溶性、低表面张力的有机溶液如乙醇等对样品进行梯度脱水，也是为了在对样品进行干燥处理时尽量减少由表面张力引起的其自然形态的变化。

将处理好的、干净的盖玻片，切割成4~6mm2的小块，将待检的较浓的大肠杆菌悬浮液滴加其上，或将菌苔直接涂上，也可用盖玻片小块粘贴菌落表面，自然干燥后置光学显微镜镜检，以菌体较密，但又不堆在一起为宜；标记盖玻片小块有样品的一面；将上述样品置于1%~2%戊二醛磷酸缓冲液（pH7.2左右）中，于40C冰箱中固定过夜。次日以0.15%的同一缓冲液冲洗，用40%、70%、90%和100%的乙醇分别依次脱水，每次15min。脱水后，用醋酸戊脂置换乙醇。

另一种与之类似的样品制备方法是采用离心洗涤的手段将菌体依次固定及脱水，最后涂布到玻片上。其优点是：①在固定及脱水过程中可完全避免菌体与空气接触，从而可最大程度地减少因自然干燥而引起的菌体变形；②可保证最后制成的样品中有足够的菌体浓度，因为涂在玻片上的菌体在固定及干燥过程中有时会从玻片上脱落；③确保玻片上有样品的一面不会弄错。

2.干燥

将上述制备的样品置于临界点干燥器中，浸泡于液态二氧化碳中，加热到临界点温度（31.40，72.8个大气压）以上，使之气化进行干燥。

样品经脱水后，有机溶剂排挤了水分，侵占了原来水的位置。水是脱掉了，但样品还是浸润在溶剂中，还必需在表面张力尽可能小的情况下将这些溶剂“请”出去，使样品真正得到干燥。目前采用最多、效果最好的方法是临界点干燥法。其原理是在一装有溶液的密闭容器中，随着温度的升高，蒸发速率加快，气相密度增加，液相密度下降。当温度增加到某一定值时，气、液二相密度相等，界面消失，表面张力也就不存在了。此时的温度及压力即称为临界点。将生物样品用临界点较低的物质置换出内部的脱水剂进行干燥，可以完全消除表面张力对样品结构的破坏。目前用得最多的置换剂是二氧化碳。由于二氧化碳与乙醇的互溶性不好，因此样品经乙醇分级脱水后还需用与这两种物质都能互溶的“媒介液”醋酸戊脂置换乙醇。

3.喷镀及观察

将样品放在真空镀膜机内，把金喷镀到样品表面后，取出样品在扫描电镜中进行观察。

五、实验报告

1.结果

描述你所制备的细菌的pB322质粒DNA电镜制片在电子显微镜下所观察到的形态特点。2.思考题

（1）利用透射电子显微镜来观察的样品为什么要放在以金属网作为支架的火棉膜（或其他膜）上？而扫描电子显微镜则可以将样品固定在盖玻片上？

（2）用负染色法制片时，磷钨酸钠或磷钨酸钾起什么作用？