哺乳动物细胞蛋白表达—细胞的培养

活性蛋白整体方案

哺乳动物细胞蛋白表达—细胞的培养

摘要：本文主要介绍了哺乳动物细胞培养的相关知识，主要包括细胞培养的基本原则，HEK293和CHO细胞培养的方法以及细胞的冻存，复苏。

随着细胞基因工程的不断发展，目前有多种生物表达系统都能够大规模的生产重组蛋白，主要分为原核和真核两类。真核表达系统又包括：酵母表达系统，哺乳动物细胞表达系统，昆虫杆状病毒。相比之下，哺乳动物细胞表达系统最突出的优点是能够促进蛋白的正确折叠和糖基化等翻译后修饰，从而保证蛋白的天然活性，目前已成为表达和生产部分蛋白药物、基因工程抗体等目的蛋白的首选宿主。

细胞培养基本原则

1.合适的细胞培养基

合适的细胞培养基是细胞在体外生长最重要的条件，培养基不仅提供给细胞生长繁殖需要的基础物质，还维持细胞生长的整个环境，不同的细胞有不同的生长习性，因此要选择合适的培养基

2.优质血清

目前，多数的合成培养基都有添加血清，常用的血清有小牛血清、马血清等。血清中含有细胞生长所必须的生长因子，作为哺乳动物细胞培养的附加物，血清十分昂贵且存在多种问题，因此人们在不断寻找可以替代血清的物质3.无毒无菌的生长环境

体外生长的细胞缺乏对微生物和有毒物质的抵御能力，一旦被污染，会导致细胞死亡，无毒无菌的培养环境是必要条件

4.温度与气体环境

细胞生长需要恒定的温度，同时气体（氧气与二氧化碳）也是哺乳动物细胞培养的所必须的物质，HEK293和CHO 的细胞培养一般是37℃，5%的二氧化碳环境。

哺乳动物蛋白表达细胞的培养

哺乳动物蛋白表达常用的细胞有HEK293（人胚肾细胞）和CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。这两种细胞的应用最为广泛，是在真核系统蛋白表达中最常用的细胞，具有以下特点：

1）具有准确的转录后修饰功能，表达蛋白在任何方面都最接近天然状态

2）具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白整合稳定

3）具有较高的耐受剪切力和渗透压能力，表达水平较高

活性蛋白整体方案4）CHO属于成纤维细胞，是一种非分泌细胞，自身很少分泌内源蛋白，有利于目的蛋白的分离纯化

5）HEK293细胞具有更高的生长密度更快的生长速度，易培养，易转染

HEK293细胞培养

1.原代培养：用一定量的PBS缓冲液轻轻洗涤细胞，加入0.05%的胰蛋白酶消化，接种0.5x106个/ml的细胞密度于10ml DEME培养基中（含有10%的牛血清），37℃，180rpm震荡悬浮培养，培养2-3天后传代。

2.传代培养：当细胞生长融合率达到80-90%操作，以维持细胞的生长状态。细胞消化后加入新鲜培养基吹打至悬浮状态，，加入完全培养基，密度为3x105个/ml，分到10cm培养皿中，10ml/皿，37℃培养箱，3%的二氧化碳环境中培养。

图1图2

图1：胰蛋白酶未消化的细胞呈现致密的单层生长，图2：加入胰蛋白酶消化后的细胞基本变圆，吹打即可悬浮培养后的细胞采用血球计数板计数，细胞经0.4%的台酚蓝溶液染色测定细胞密度和活率。

293细胞在刚开始传代时易贴壁生长，在几十代以后，易聚集成团状，出现生长状态下降等现象，最好在细胞购进时就进行大量冻存，保证实验后续的稳定和持续。对对数生长期的细胞进行冻存，能够增加细胞复苏的成功率。

3.细胞的冻存

1）取要冻存的细胞，倒掉培养基，并洗涤

2）加入适量0.05%的胰蛋白酶消化，后加入新鲜的培养基吹打细胞至悬浮状态

3）收集50ml的细胞悬浮液至灭菌的离心管中，离心弃上清，加入一定量的细胞培养基

4）细胞冻存液缓慢加入至细胞悬液中，细胞终浓度为2-5x106cells/ml，标记后分装至细胞冻存管

5）将冻存管放入冻存盒中，-80℃保存，第二天可放入液氮罐中。

4.细胞的复苏

根据记录从液氮罐中取出冻存细胞，迅速放入已经预热至37℃的水浴中，快速摇晃，两分钟内使细胞完全融化，

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转移到超净工作台内，接种至50ml的培养瓶中，混匀后放置到5%二氧化碳，37℃的环境中培养。

刚复苏的HEK293细胞生长缓慢，尽量减少在细胞复苏24小时内观察次数，或不观察，复苏48小时后换液最为合适，避免因晃动而让细胞贴壁，为下一步的转染做准备。

CHO细胞培养

传统CHO细胞的培养都是采用DEME培养基培养（10%牛血清)，血清提供营养也能促进dna的合成，因血清价格昂贵且成分尚不明确，不同批次也可能导致差异，因此经济实用的无血清培养基成为细胞培养的必然需求。1.无血清培养基配置

纯水溶解制备一定量的袋装培养基I，加人2.45g NaHC03，用NaOH将pH调为8.0，再用HC1调回至pH7.1，定容后过滤除菌。

2.细胞培养

用含血清的常规培养基和无血清培养基（体积1:1）悬浮细胞，接种3×105个/ml，37℃培养，待细胞密度为5×105个/m1，用无血清培养基稀释到3×105个/ml，重复操作，直至血清浓度降低为0.1%

3.传代培养

待血清浓度降为0.1%时，用无血清培养基培养细胞至3×106个/ml，接种3×105个/ml进行传代培养

4.细胞的冻存

1）取要冻存的细胞，倒掉培养基，并洗涤

2）加入适量0.05%的胰蛋白酶消化，后加入新鲜的培养基吹打细胞至悬浮状态

3）收集50ml的细胞悬浮液至灭菌的离心管中，离心弃上清，加入一定量的细胞培养基

4）细胞冻存液缓慢加入至细胞悬液中，细胞终浓度为2-5x106cells/ml，标记后分装至细胞冻存管

5）将冻存管放入冻存盒中，-80℃保存，第二天可放入液氮罐中。

5.细胞的复苏

根据记录从液氮罐中取出冻存细胞，迅速放入已经预热至37℃的水浴中，快速摇晃，两分钟内使细胞完全融化，转移到超净工作台内，接种至50ml的培养瓶中，混匀后放置到5%二氧化碳，37℃的环境中培养。

注意事项

1.细胞的培养大瓶好于小瓶，细胞能够充分汲取到养分且有利于细胞均匀分布

2.细胞培养基DEME为高糖培养基