亲水相互作用色谱_高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖_吴成玲

质素（ KS） 。糖胺聚糖类与蛋白质相互作用的特异性取决于糖胺聚糖种类 、 大小、 糖组成、 电荷密度和序 ［4 ， 5 ］ 2! 。相对于糖胺聚糖的其它结构特征 ， SO4 的数量 （ 电荷密度 ） 对于调节生物学功能来说具有更 列等
［9 ］ ! 。糖胺聚糖所含 SO2 。糖胺聚糖类寡糖经常 4 数目多少大体排序为 HP＞DS ≈ CS ≈ HS＞HA 被作为模型， 用于研究糖胺聚糖结构与活性的关系 。针对不同糖胺聚糖构效关系研究、 糖胺聚糖酶活力
0531 接受 20150321 收稿； 2015本文系国家自然科学基金（ No． 81473179 ） 资助 * Email： liujianfen888@ 163． com； z_zhang@ suda． edu． cn
第8 期
吴成玲等： 亲水相互作用色谱高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖
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大影响
［6 ～ 8 ］
测定、 糖胺聚糖降解程度、 糖胺聚糖寡糖制备的监控， 建立有效的糖胺聚糖寡糖在线分析方法至关重要 。 目前， 用于分析糖胺聚糖类寡糖的方法有强阴离子交换 （ SAX ） 高效液相色谱 （ HPLC ） 和反相离子
［10 ～ 12 ］ 对（ IPＲP） 色谱 等。然而， 强阴离子交换色谱方法呈现出较低的分辨率和稳定性 ， 同时它使用的高 浓度的无机缓冲盐溶液限制了它与质谱的联用 ， 从而无法在线检测所得寡糖的分子量、 组成和序列；
2． 2 2． 2． 1
实验方法
CSA 寡糖 分别取 2． 0 mg HA 和 CSA 样品溶于 400 μL 酶解缓冲液 酶水解制备 HA 寡糖、 （ 10 mmol / L 磷酸盐缓冲液， pH 6． 8 ） ， A 样品配制成 5 mg / mL 溶液， 将 HA 和 CS分别加入软骨素酶 ABC 5 mU， 置于水浴箱中 37℃ 反应 4 h。酶解液高温灭活然后离心， 上清液备用。 HILIC） 流动相 A 为 5 mmol / L 醋酸铵溶液， 寡糖的高效液相亲水相互作用色谱分析 （ HPLC95% 乙腈溶液， HILIC 色谱柱 流动相 B 为 5 mmol / L 醋酸铵紫外检测器设置为 232 nm 在线检测。氨基-
1
引
言
糖胺聚糖是在细胞表面和细胞间基质中被发现的呈线性的酸性多糖 。糖胺聚糖通过调节多种细胞 活动从而参与到生理和病理学过程中 ， 如细胞的扩增和分化， 细胞与细胞的相互作用以及细胞与细胞间
［1 ～ 3 ］ 。糖胺聚糖基于它们的单糖组成以及单糖之间糖苷键的位置和构象 ， 基质的相互作用等 可以大体 分为 4 类： 透明质酸（ HA） ， 硫酸皮肤素 / 硫酸软骨素 （ DS / CS ） ， 硫酸乙酰肝素 / 肝素 （ HS / HP ） 和硫酸角
1200
分析化学
第 43 卷
A 具有较好的分辨率 （ 图 2C ） 。 但此 失， 同时还保留了较高的分辨率（ 图 2B ） 。此外， 此色谱柱也对 CS色谱柱不适用于 HP 的分离分析。
dp4
30 20
A
dp2
dp6 dp8 dp10 dp12 dp14 dp16 dp18 dp20 dp22 dp24 dp30
A232 （ mAU ）
30 20
dp2 dp4 dp6 dp8 dp10 dp12 dp14 dp18 dp20 dp16
性盐的离子强度太弱， 无法对寡糖进行洗脱， 因此 HPLCMS 。 不能进行 分析 3． 2 分离 HILIC 色 谱 柱 分 别 对 HA、 CSA 采用 酰 胺 基HA 寡聚糖能够得到很 和 HP 进行分析， 结果表明， 好的分离， 如图 1 所示。 根据相应质谱结果 （ 图谱 未显示） ， 色谱图中每个峰得到了准确的归属。 其 中 HA 寡聚糖在聚合度 2 ～ 20 的范围内能够得到 A 与 HP 很好的分离。然而在使用此色谱柱对 CS寡糖混合物进行分离时， 在合理的缓冲盐浓度范 围内无法有效洗脱寡糖 （ 谱图未显示 ） 。该色谱柱 能够 树脂表面的酰胺基团具有较弱的离子作用， HILIC 色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的 酰胺基-
IPＲP 方法有较好的分辨率， 而且所使用的挥发性离子对试剂可以用于质谱， 但是它们通常残留在离子 源和毛细管中， 从而降低了质谱的灵敏度和分辨率
［13 ， 14 ］
。
本研究针对具有不同电荷密度的糖胺聚糖寡糖 ， 采用 4 种基质的亲水相互作用色谱 （ HILIC ） 方法。 HILIC 方法有更好的质谱兼容性； 同时， 研究表明， 与 SAX 和 IPＲP 方法相比， 针对不同的糖胺聚糖寡糖 可以选择不同的 HILIC 方法。
A 寡聚糖分 聚糖分离谱图（ B） 色谱柱 85℃ 条件下所得 HA 寡聚糖分离谱图（ C） 色谱柱 85℃ 条件下所得 CS离谱图 Fig． 2 HA / chondroitin sulfate A（ CSA） oligosaccharides obtained on the zwitterionic （ ZIC ） HILIC column． （ A ） Chromatogram of HA oligosaccharides obtained on ZICHILIC column at 30℃ ； （ B ） ZICHILIC column at 85℃ ； and （ C） ZICHILIC column at 85℃
2． 2． 2
（ 250 mm×4． 6 mm， 5 μm，日本 COSMOSIL 公司） ； 酰胺基HILIC 色谱柱（ 250 mm×4． 6 mm， 5 μm， 北京 30 min 内流动相 B 从 90% 降到 35% 进行梯度洗脱； 两性 华谱新创公司） ， 柱温 30℃ ， 流速 0． 5 mL / min， HILIC 色 谱 柱 （ 100 mm × 2． 1 mm，5 μm， 离子 （ ZIC ） 德 国 Merck 公 司 ） ， 柱 温 30℃ /85℃ ， 流速 0． 3 mL / min， 25 min 内流动相 B 从 90% 降到 35% 进行梯度洗脱； 二醇基HILIC 色谱柱 （ 150 mm × 3 μm LUNA，加拿大 Phenonenex 公司 ） ， 25 min 内流动相 B 从 2． 0 mm， 柱温 30℃ ， 流速 0． 3 mL / min， 90% 降到 35% 进行梯度洗脱。 寡糖的质谱分 析 氮 气 用 作 雾 化 气， 雾 化 压 力 为 30 Pa。 喷 雾 电 压 为 3． 5 kV， 氮气流速为 8 L / min， 干燥过程中温度为 350℃ 。碎片电压为 100 V。 在 m / z 100 ～ 2000 的范围内进行全离子流扫 2． 2． 3 描。所有数据都在负离子模式下进行采集 ， 经 Mass Hunter 工作站下处理。
3
3． 1
结果与讨论
HILIC 色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分析 氨基15］ HILIC 色谱柱已被用于糖胺聚糖二糖分析［15］， 在文献［ 中， 氨基但该法以高浓度不挥发性缓冲
因此无法与质谱联用， 而且对于寡糖的分离和分析并没有直接的报道 。 本实验使用氨 盐作为流动相， HILIC 色谱柱进行糖胺聚糖的寡糖分析 ， 基结果表明， 即使在高浓度醋酸铵缓冲盐的条件下， 寡聚糖仍 然无法被完全洗脱（ 谱图未显示） ， 而据经验 100 mmol / L 以上的挥发性盐已经对质谱检测造成了影响 。 造成这种现象可能是该氨基柱中树脂表面键合的 氨基基团与糖胺聚糖寡糖结合作用太强， 而挥发
A232 (mAU)
10 0 -10 2.5 50 B 0
dp2 dp6 dp4 dp8
dp26
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0 t (min)
17.5
dp28
20.0
22.5
25.0
25.5
A232 (mAU)
-50 -100 -150 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5
dp10 dp12 dp16 dp18 dp14 dp22
与含有较少负电荷的 HA 的寡聚糖产生适当的相互作用， 并能够有效分离 HA 寡糖。 3． 3 两性离子（ ZIC） HILIC 色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分析 HILIC 色谱柱分别对 3 种糖胺聚糖类寡糖进行了分析。结果表明， HA 寡糖在聚合 本实验使用 ZIC度 2 ～ 28 的范围内达到较好分离， 如图 2A 所示， 其中质谱结果确认了它们的聚合度 （ 图谱未显示 ） 。 ZICHILIC 的两性离子基质使得 HA 寡聚糖达到了更高的分辨率。 然而 HA 的每一个寡糖都分裂成了 16 ， 17 ］ ， 两个峰， 这是由寡糖还原端产生的 α和 β构型共存导致的 （ 图 2A ） 。根据文献［ 增加柱温可以 减少或消除这种现象。因此， 本实验中将柱温升高到 85 "C ， 每个 HA 寡糖在常温下出现的双峰完全消
3． 4
2
2． 1
实验部分
仪器与试剂 Agilent 1260 Infinity 液相色谱仪串联四级杆 / 飞行时间（ Q / TOF ） 质谱（ 6540， 美国 Agilent 公司） 。醋 A（ CSA） 和 HA（ 美国 Sigma 公司） ； 乙腈（ 德国 Merck 公司） ； 软骨素 ABC 酶（ Chondroiti酸铵、 硫酸软骨素nase ABC， 北京艾德豪克国际技术有限公司） ； 低分子量肝素： 依诺肝素为美国药典标准品（ USP） 。
10 0 -10 -20 -30 18 20
22 24 t （ min ）
26
28
30
图1 Fig． 1
酰胺基亲水相互作用色谱柱 30℃ 条件下所得透 Chromatograms of hyaluronic acid （ HA ） obtained on
明质酸分离谱图 amidehydrophilic interaction liquid chromatography（ HILIC） column
第 43 卷 2015 年 8 月
分析化学 （ FENXI HUAXUE）
研究报告
第8 期 1198 ～ 1202
DOI： 10． 11895 / j． issn． 02533820． 150228
Chinese Journal of Analytical Chemistry
亲水相互作用色谱 - 高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖
吴成玲
1
1
刘建芬
Байду номын сангаас
* 2
2
张真庆
* 1
（ 苏州大学药学院，苏州 215123 ）
（ 协和制药， 石家庄 050083 ）
摘
要
建立了亲水相互作用 液相色谱质谱联用分析糖胺聚糖类复杂样品的方法 。 在高分辨质谱联用条
件下， 流动相 5 mmol / L 醋酸铵缓冲溶液可有效使用 。在此基础上， 对不同的色谱柱进行了筛选 。 其中， 氨基 亲水相互作用色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分离效果不佳； 酰胺基亲水相互作用色谱柱仅适用于透明质酸寡 糖的分析， 可以有效分离聚合度 2 ～ 20 的透明质酸寡糖； 在较高温度下， 两性离子基质的亲水相互作用色谱柱 可以对聚合度 2 ～ 30 的透明质酸寡糖和聚合度 2 ～ 12 的硫酸软骨素寡糖有效分离； 而二醇基亲水相互作用色 谱柱对透明质酸（ 聚合度 2 ～ 30 ） 、 硫酸软骨素（ 聚合度 2 ～ 20 ） 以及肝素（ 聚合度 4 ～ 20 ） 都适用， 并呈现出较 好的分离效果。本研究比较了不同类型的亲水相互作用色谱结合高分辨质谱对不同聚合度 、 不同电荷密度的 糖胺聚糖寡糖的分离特点， 建立了相应的高效分离和分析方法 。本方法有较高的分辨率和质谱适用性 。 关键词 亲水相互作用色谱； 四极杆 / 时间飞行质谱； 糖胺聚糖； 寡糖
dp20 dp24
15.0 t (min)
17.5
20.0
22.5
25.0
25.5
5 -5 -15 -25 -35 2.5
C
dp2 dp4 dp6 dp8 dp10 dp12
A232 (mAU)
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0 t (min)
17.5
20.0
22.5
25.0
25.5
图2
HILIC 色谱柱所得 HA / 硫酸软骨素 A 寡聚糖分离谱图。（ A） 色谱柱 30℃ 条件下所得 HA 寡 两性离子-