亲水相互作用色谱_高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖_吴成玲
亲水作用色谱—质谱联用法同时测定参附注射液中的14种有机酸
亲水作用色谱—质谱联用法同时测定参附注射液中的14种有机酸作者：刘瑶张娜史社坡宋青青李军宋月林屠鹏飞来源：《中国中药杂志》2016年第18期[摘要]有机酸广泛分布在植物及相关产品中，其参与多种代谢途径（如三羧酸循环），并表现出多种药理活性。
参附注射液作为广泛使用的中药注射剂，不良反应时有报道。
因而，应深入阐明参附注射液的化学组成，并制定严格的质量标准，进而保障其临床使用安全有效。
参附注射液由红参及黑顺片经现代工艺提取制备而成，有机酸为其主要成分类别之一。
该研究通过建立HTTJTC-LC-MS，同时测定参附注射液中肉桂酸、阿魏酸、4-羟基苯甲酸、乳酸、己二酸、延胡索酸、咖啡酸、琥珀酸、马来酸、丙二酸、苹果酸、莽草酸、酒石酸和金鸡纳酸等14种有机酸成分的含量。
14种有机酸类成分在HTTJTC色谱柱上均获得较好的保留和分离。
除肉桂酸（231μg·L-1）、乳酸（113μg·L-1）和丙二酸（32.5μg·L-1）外，其余11个化合物的定量限均小于10μg·L-1。
定量结果表明，苹果酸、丙二酸、奎尼酸、乳酸和肉桂酸在参附注射液中含量较高（>1.89 mg·L-1），而10批样品中均未检测到咖啡酸和己二酸。
该方法适用于参附等中药注射液中多种有机酸含量的同时测定。
[关键词]有机酸；参附注射液；多成分含量测定；亲水作用色谱法；质谱参附注射液由红参和黑顺片经现代工艺提取制备而成，具回阳救逆、益气固脱之功效，为临床常用中药注射剂。
主要用于阳气暴脱的厥脱症（感染性、失血性、失液性休克等）及阳虚（气虚）所致的惊悸、怔忡、喘咳、胃疼、泄泻、痹症等作为广泛使用的中药注射剂。
参附注射液的不良反应时有报道。
因此，应深入阐明参附注射液的化学组成，并制定严格的质量标准。
有机酸作为参附注射液的主要化学成分类别之一，在其药效作用及不良反应中均发挥了重要作用。
有机酸广泛分布于植物的根、叶、果实等部位。
亲水作用色谱分析吡啶离子液体阳离子
亲水作用色谱分析吡啶离子液体阳离子丁彩云 摘要：本研究建立了一种亲水作用色谱结合紫外检测分析吡啶离子液体阳离子的方法。
以哌啶离子液体为流动相添加剂，明显地改善了吡啶阳离子的分离效果，吡啶阳离子可在短 时间内实现良好的分离检测。
吡啶离子液体阳离子在亲水色谱柱上的保留行为符合亲水作用 色谱的特点, 并且其保留规律符合碳数规律。
采用以氨基甲酰基为功能基团的亲水相互作用 色谱柱，以 3.0 mmol/L N-甲基-N-丁基哌啶四氟硼酸盐(水/乙腈, 40/60, v/v) 为流动相， 以 215 nm 为紫外检测波长，在接近室温的 35°C 下进行分析。
N-辛基吡啶阳离子、N-己基 吡啶阳离子和 N-丁基吡啶阳离子可在 10 min 内完成分离、检测。
检出限(S/N=3)分别为 0.003、 0.005 和 0.017 mg/L，7 次测定保留时间和峰面积的相对标准偏差均小于 0.4%。
关键词 ：亲水相互作用色谱；紫外检测；吡啶阳离子；离子液体离子液体是由离子组成的，在室温或接近室温下呈液态的盐类[1, 2]。
其中阳离子一 般为对称性低的有机阳离子，阴离子一般为体积较小，对称性较好的无机弱配位阴离子或有 机阴离子。
根据离子液体阳离子的化学结构不同，离子液体可以分为咪唑类、吡啶类、季铵 类和季鏻类等。
与传统溶剂相比，离子液体具有很多独特的物理化学性质，如液程宽、不挥 发、溶解能力强、不可燃、热容量大、离子导电率高、萃取能力好、相稳定性好、 热稳定 性好、水稳定性好、酸碱稳定性好等、绿色环保等特点[3-6]。
因此，其已被广泛应用于分析 化学[7-12]、环境科学[13]、有机合成[14]及电化学[15-17]等领域和成为诸多领域的研究热点。
例如， 在液相色谱中离子液体可作为流动相添加剂[18-21]和固定相[22-25]等。
随着离子液体应用范围的 不断扩大，势必会导致其流失到环境中。
因此，越来越多研究者的关注离子液体会对环境造 成的污染有多大、在自然界中的降解程度怎么样以及离子液体的生物毒性又如何等问题。
寡糖的重均分子量
寡糖的重均分子量【原创版】目录1.寡糖的定义和重要性2.寡糖重均分子量的概念3.寡糖重均分子量的测量方法4.寡糖重均分子量的应用5.寡糖重均分子量的研究进展正文1.寡糖的定义和重要性寡糖，又称低聚糖，是由 2-10 个单糖分子通过糖苷键连接而成的碳水化合物。
它们广泛存在于水果、蔬菜和动物乳汁中，具有重要的生理功能，如调节肠道菌群、增强免疫力等。
因此，研究寡糖的性质对于了解其生理作用及开发相关产品具有重要意义。
2.寡糖重均分子量的概念寡糖重均分子量（Average Molecular Weight, AMW）是指寡糖分子量的平均值，通常用克/摩尔表示。
它是衡量寡糖分子量大小的重要指标，对于研究寡糖的结构、功能和生物活性具有重要意义。
3.寡糖重均分子量的测量方法寡糖重均分子量的测量方法主要包括以下几种：（1）凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography, GPC）：这是一种常用的测量方法，基于分子大小不同，通过凝胶柱的速率不同，从而实现对寡糖分子量的分离和测定。
（2）质谱法（Mass Spectrometry, MS）：通过质谱分析，可以准确测量寡糖的分子量，但通常需要与其他方法相互验证。
（3）光散射法（Light Scattering, LS）：光散射法通过测量溶液中寡糖颗粒对光的散射程度，推算出分子量。
这种方法简便快速，但准确性相对较低。
4.寡糖重均分子量的应用寡糖重均分子量对于研究寡糖的生物活性、消化吸收、结构特征等方面具有重要意义。
此外，在生产过程中，控制寡糖的重均分子量可以提高产品质量和稳定性。
5.寡糖重均分子量的研究进展随着科学技术的发展，寡糖重均分子量的研究取得了显著进展。
例如，通过改进测量方法和仪器设备，提高了测量的准确性和效率；对于不同类型的寡糖，研究了其重均分子量与生物活性之间的关系，为开发高生物活性的寡糖产品提供了理论依据。
亲水作用色谱-串联质谱法测定稻米中的草甘膦和氨甲基磷酸残留量
基 团 ， 以直接 利用 紫外 和荧 光检测 器进 行检测 ， 难 因
此， 柱前 或 柱后 衍 生 方 法 常 用 于 改 善 Ｇ 和 ＨＰ Ｃ Ｃ Ｌ
的色谱 行为及 提 高检测 响应值 。如早期 常采用 三氟
乙酸酐 和三 氟 乙醇 等用 于 Ｇ 的柱前 衍 生 “ ， 一 Ｃ ９ 芴 基 甲 基 氯 仿 （ ＭＯ － １ 等 用 于 Ｈ Ｌ 柱 前 衍 Ｆ ＣＣ） ＰＣ 生 ¨ 结合 氮 磷 检 测 器 （ Ｄ） 荧 光 检 测 器 进 “ ， ＮＰ 或
最 大 的广谱非 选择 性 除 草 剂 ， 可有 效 防除 一 年生 与
多 年 生 的禾 本 科 、 子 叶杂 草 及 灌 木 等 双 ， ００ ２ １
年 全球 总需求 量为 ７ ７ ０～ ５万 吨左右 ， 国年需求 量 我
亲水作 用色谱 柱 、 动相 组 成 及 质谱 条 件 等 对测 定 流 灵 敏 度 、 密度 的影 响 ， 精 考察 了提取 和净 化方式 对方
法 回收率 的影 响。
达 ５万吨左 右 。虽然 草甘 膦属 于低毒 类 的有 机磷 除草剂 ， 但其 不合 理 的使 用 仍 会 导致 其 过 高 地残 留 于植物 体 中。草 甘 膦 及 其 主要 代 谢 物 氨 甲基 磷 酸
（ ｍｉｏ ｔｙ ｈ ｓ ｈ ｎｃ ａ ｉ ，Ａ Ａ） 有 与 有 ａ ｎ ｍｅｈ ｌ ｏ ｐ ｏ ｉ ｃｄ ＭＰ 具 ｐ
行定 量分 析 ， 方法 灵敏 度低 ， 但 不方 面 ， 于缺 少生 色 Ｈ Ｌ 进 另 由
１ ３ 标 准储 备液和 工作 溶液 的配 制 ． Ｇ ｙ和 Ａ Ａ标 准储 备液 ： ｌ ＭＰ 分别称 取 １ （ ０ｍｇ 精 确 至 ０ ０ ） Ｇｌ Ａ Ａ标准 品 ， 水溶 解并 ． １ｍｇ 的 ｙ和 ＭＰ 用
亲水作用色谱-电喷雾串联质谱法测定水产品中的氟苯尼考胺的残留量
亲水作用色谱-电喷雾串联质谱法测定水产品中的氟苯尼考胺的残留量刘正才;张琼;杨方;林永辉;刘素珍;苏芝娇【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2015(036)004【摘要】建立亲水作用色谱-电喷雾串联质谱测定水产品中氟苯尼考胺残留量的测定方法.样品用碱性乙酸乙酯提取,以正己烷和脂肪吸附材料去除油脂,用5 mmol/L 乙酸铵溶液(含0.2％甲酸)和乙腈作为流动相,以梯度洗脱方式在Acquity UPLC BEH HILIC柱(55 mm×2.1 mm,1.7 μm)色谱柱上分离,以电喷雾离子源正离子模式进行质谱分析,基质外标法定量.结果表明,氟苯尼考胺的质量浓度在0.1～20μg/L 范围内呈良好的线性,相关系数(r2)大于0.990.在1.0～50.0 μg/kg加标水平下,虾、黄鱼、鳗鱼、烤鳗的平均回收率为70.5％～87.7％,相对标准偏差为4.8％～11.6％,定量限为1.0 μg/kg.该方法简单、灵敏、稳定,可满足水产品中氟苯尼考胺残留量的检测和确证需要.【总页数】4页(P198-201)【作者】刘正才;张琼;杨方;林永辉;刘素珍;苏芝娇【作者单位】福建出入境检验检疫局福建省检验检疫技术研究重点实验室,福建福州 350001;福建出入境检验检疫局福建省检验检疫技术研究重点实验室,福建福州350001;福建出入境检验检疫局福建省检验检疫技术研究重点实验室,福建福州350001;福建出入境检验检疫局福建省检验检疫技术研究重点实验室,福建福州350001;福建出入境检验检疫局福建省检验检疫技术研究重点实验室,福建福州350001;福建出入境检验检疫局福建省检验检疫技术研究重点实验室,福建福州350001【正文语种】中文【中图分类】O657.63【相关文献】1.亲水作用色谱-串联质谱法测定化妆品中三聚氰胺残留量 [J], 梅少博;侯晋;张文国;倪鹏;殷烈;丁黎2.亲水作用色谱-电喷雾串联质谱法检测原料奶及奶制品中的三聚氰胺 [J], 严丽娟;吴敏;张志刚;周昱;林立毅;方恩华;徐敦明;陈鹭平3.亲水作用色谱-电喷雾串联质谱法测定生鲜牛乳及奶粉中的双氰胺 [J], 李丹妮;顾欣;严凤4.亲水作用色谱-串联质谱法测定动物源运动食品中3种氨基糖苷类抗生素的残留量 [J], 宫明明5.亲水作用液相色谱电喷雾串联质谱法测定米线中乌洛托品残留 [J], 陆春良;刘娟;刘向农因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
(分析化学)亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用
研究报告DOI :10.3724/SP.J.1096.2014.30310亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用江静1,2 应万涛*2 钱小红*21(中国人民解放军总医院,军医进修学院,北京100039)2(蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,解放军医学院,北京102206)摘 要 蛋白质的糖基化修饰在生理及病理过程中发挥着重要作用㊂由于技术条件的限制,传统的糖蛋白分析方法中,通常分别鉴定蛋白质和糖链两者的结构,而忽略了蛋白质与糖链的连接关系㊂本研究旨在以完整糖肽作为检测对象,对糖肽中肽段序列和糖链结构的同步解析㊂采用亲水相互作用色谱对完整糖肽进行分离纯化,联合生物质谱中碰撞诱导解离(CID)㊁高能诱导解离(HCD)㊁电子转移解离(ETD)等裂解模式,对完整糖肽的糖基化位点㊁糖链结构㊁肽段序列等进行全方面的解析㊂结果表明,亲水相互作用色谱中样品与填料比1∶50可有效富集糖肽,采用30%CID 能量,主要产生糖苷键断裂的碎片,为糖链的结构组成分析提供了线索;采用25%HCD 能量,在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息,并产生明确的糖肽Y1特征离子;ETD 保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂,可以提供有效的肽段序列信息㊂本研究结合亲水相互作用色谱与质谱仪中的多种碎裂方式,为完整糖肽的结构解析提供了一种快速㊁有效的研究方案㊂关键词 亲水作用色谱;串联质谱;完整糖肽;碰撞诱导解离;高能诱导解离;电子转移解离 2013⁃06⁃07收稿;2013⁃08⁃05接受本文系国家高技术研究发展计划(No.2012AA020203)㊁国际科技合作项目(No.2011DFB30370)㊁北京市科技新星计划(No.Z121107002512014)资助*E⁃mail:yingwtll@,qianxh1@ 1 引 言蛋白质的糖基化修饰是生物体内普遍存在的一种重要翻译后修饰方式[1,2],但其研究面临很多挑战㊂糖基化修饰具有多样性㊂糖基化修饰没有任何模板[3],而是由200多种糖基转移酶调控,同一蛋白质的不同位点的修饰水平不一,同一位点所携带的糖链也存在多种结构,这给分析技术和软件工具带来了巨大挑战;目前完整糖肽的分析手段有限,主要以质谱分析为主,但由于糖肽修饰的微不均一性,及在质谱中离子化困难㊁碎裂情况复杂等特点,严重制约了完整糖肽的富集和质谱分析技术的发展㊂2012年,Doerr 等[4]总结了糖蛋白质结构解析的经典研究手段,并指出主要的研究方法是先将糖链从蛋白上释放,然后分别对两者进行解析,这导致了蛋白与糖链之间联系的缺失㊂聚糖结构解析[5],可以解析大量糖链结构,却忽视了糖链的来源;蛋白部分研究[6],可以得到明确的蛋白序列及大规模糖基化位点,却丢失了糖链信息㊂Nakano 等[7]研究发现,特异位点的糖基化修饰影响生物学功能,这表明位点特异性水平的糖基化修饰研究对进一步阐释糖蛋白质的生理功能及其在病理过程中的变化具有重要意义㊂因此,开发完整糖肽水平的研究方法,保留蛋白质与聚糖之间的连接,已成为当前的研究热点㊂完整糖肽的复杂结构对分析方法的制约,需要从富集和鉴定两方面解决㊂首先是由不均一性导致的糖肽低化学计量水平,及其在质谱中离子化效率不高而受非糖肽信号抑制的问题㊂可以通过完整糖肽的富集与分离,去除非糖肽的干扰而提高糖肽的相对丰度㊂目前应用于富集糖蛋白/糖肽的方法主要有凝集素[8]㊁二氧化钛[9]㊁酰肼[10]和亲水相互作用色谱(Hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)[11]等㊂其中,HILIC 是基于富含多羟基的糖链结构的强亲水特性,而使糖肽与非糖基化肽段得以分离㊂HILIC 对不同类型的糖肽没有偏性,且能保持糖链结构的完整性,适合作为完整糖肽结构研究中的富集技术㊂其次,完整糖肽包含肽段和糖链两部分,其结构和连接方式的差异导致两者在串联质谱第42卷2014年2月 分析化学(FENXI HUAXUE ) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第2期159~165061 分析化学第42卷中的碎裂行为有较大的区别,仅采用经典的碰撞诱导解离(Collision⁃induced dissociation,CID)碎裂不能有效得到糖肽的全面信息,Wiesner等[12]指出,电子转移解离(Electron transfer dissociation,ETD)碎裂模式在蛋白质翻译后修饰研究中,可以补充CID的不足而发挥重要作用,高能诱导解离(High energy colli⁃sional dissociation,HCD)可以提供更为丰富的低分子段碎片离子信息㊂多种碎裂方式联合的方法在蛋白质组学中也已经得到有效应用[13],多种碎裂方式联合应用的方式可以为完整糖肽研究提供借鉴㊂本研究以完整糖肽作为检测对象,制作了HILIC富集装置,并联合CID,HCD,ETD等多种串联质谱碎裂方式,在解析糖链结构的同时,获取肽段序列以及糖基化位点信息,从而实现糖蛋白结构的全面解析㊂2 实验部分2.1 仪器、试剂与材料基质辅助激光解吸附电离飞行时间串联质谱仪(UltrafleXtremeMALDI⁃TOF/TOF⁃MS,德国Bruker Daltonics公司);电喷雾电离⁃线性离子阱⁃静电场轨道阱质谱仪(ESI⁃LTQ⁃Orbitrap⁃XL,美国Thermo Fisher公司);离心机㊁冷冻干燥离心机(美国Thermo Fisher公司);HILIC小柱(自制,亲水相互作用填料为博纳艾杰尔科技产品)㊂牛胎球蛋白(Fetuin)㊁核糖核酸酶B(RNase B)㊁2,5⁃二羟基苯甲酸(DHB)㊁乙腈(美国Sigma公司);肽⁃N⁃糖苷酶F(PNGase F,NEB公司);胰酶Trypsin(测序级,美国Promega公司);二硫苏糖醇(DTT,美国GE公司),碘乙酰胺(IAA,比利时Acros公司),三氟乙酸(TFA)㊁甲酸(美国Fluka公司);其它试剂均为国产分析纯,实验用水为Milli⁃Q制备的超纯水㊂2.2 实验方法2.2.1 糖蛋白酶解 取适量牛胎球蛋白或核糖核酸酶B蛋白,溶解于50mmol/L NH4HCO3㊂加入适量DTT,使终浓度为10mmol/L,56℃水浴1h㊂加入IAA,使其终浓度为40mmol/L,暗处反应30min㊂加入终浓度为10mmol/L DTT封闭过量的IAA㊂按质量比1∶50加入胰酶进行酶切,37℃反应过夜㊂反应溶液置于95℃水浴10min,灭活胰酶,终止酶解反应㊂2.2.2 HILIC小柱富集完整糖肽 本实验使用由移液枪头自制的HILIC小柱富集纯化蛋白酶切混合物中的糖肽㊂首先,用80%乙腈,1%FA,冲洗活化小柱,然后,浓缩的酶切混合物,溶于50μL80%乙腈,1%FA溶液,上样于HILIC小柱㊂再用100μL80%乙腈,1%FA溶液进行脱盐,重复3次㊂最后用5%乙腈,1%FA溶液100μL洗脱,收集糖肽㊂洗脱溶液用冷冻干燥离心机旋干,-20℃保存待用㊂2.2.3 MALDI⁃TOF/TOF⁃MS分析条件 肽段或富集后的糖肽与DHB(2,5⁃二羟基苯甲酸)基质1∶1混合点靶㊂采用正离子反射模式,离子源电压20kV,脉冲离子提取电压18.8kV,离子提取延时时间110ns,激光频率2000Hz,激光能量50%,每张谱图共采集1500个激光点,校准相对误差≤5ppm㊂分析质谱图谱的软件为FlexAnalysis3.4㊂2.2.4 ESI⁃LTQ⁃Orbitrap⁃XL分析条件 HILIC小柱富集纯化得到的完整糖肽样品,溶解于50%乙腈⁃0.1%甲酸溶液中,用纳升级电喷雾离子源直接进样,采用LTQ⁃Orbitrap⁃XL质谱仪,正离子模式下扫描㊂采用碰撞诱导解离(CID);高能诱导解离(HCD);电子转移解离(ETD)等不同的碎裂方式进行碎裂,然后由Orbitrap进行检测㊂3 结果与讨论3.1 亲水相互作用色谱富集完整糖肽3.1.1 HILIC富集糖肽方法考察 本研究采用牛胎球蛋白优化HILIC小柱富集步骤㊂牛胎球蛋白由Trypsin酶切后,经PNGase F处理去除糖肽上的糖链,未经富集的Fetuin蛋白酶切产物如图1a所示㊂PNGase F去除糖链后,消除了糖链不均一性对质谱的影响,但由于样品体系的复杂性和肽段性质的差异,去糖后的糖肽在蛋白的总酶切肽段中的相对信号依然较弱㊂非糖基化肽段形成的分子离子峰1474.84对其它肽段产生了明显抑制(图1a)㊂例如,去糖后N99位的肽段[M+H]+m/z3672.7519,及N156位的肽段[M+H]+m/z1741.8247,在谱图中仅为依稀可见的两个小峰,而N176位的肽段[M+H]+m /z 3017.5538甚至难以在谱图中显现㊂基于糖肽中糖链部分的亲水性,以HILIC 填料制作的富集小柱可以用于富集并分离样品中的完整糖肽㊂蛋白质酶切混合物在高有机相溶液中上样,糖肽借助其糖链部分富含的羟基等亲水基团而保留在填料表面的水化层中,而疏水性较强的非糖基化肽段在流动相中分配系数更大而不在小柱上保留㊂继续用高有机相溶液充分清洗材料上的非特异性吸附后,由高水相溶液洗脱并收集糖肽㊂这种基于分配机制分离的色谱方法,选择合适有机溶剂含量的流动相,可以减少材料的非特异性吸附,提高富集效率㊂图1b 采用20%乙腈⁃1%甲酸溶液洗脱糖肽,图1c 采用5%乙腈⁃1%甲酸溶液洗脱糖肽,由PNGase F 处理富集后产物,经MALDI⁃TOF 质谱检测㊂图中可见,两者都可以有效的富集Fetuin 的3个N ⁃糖基化肽段㊂但在20%乙腈洗脱时,m /z 1500~2500区域内有较多非糖肽的杂峰,而在5%乙腈洗脱时,该区域中非特异性吸附引入的干扰明显减少㊂结果表明,采用5%乙腈⁃1%甲酸溶液洗脱糖肽可以进一步去除非糖肽的干扰,获得更好的糖肽富集效果㊂图1 (a)牛胎球蛋白酶切总肽段的一级质谱图;牛胎球蛋白酶切物,经亲水作用色谱柱富集,20%(b)或5%(c)乙腈洗脱产物的一级质谱图(星号标注了去糖基化后的糖肽)Fig.1 (a)Mass spectrum of fetuin peptides digests,and mass spectrum of fetuin glycopeptides enriched by hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)and then eluted by acetonitrile buffer with concentration of 20%(b)or 5%(c)(*:the deglycosylated peptides).采用移液器枪头作为HILIC 填料的载体,可以根据目标样品的多少自由选择合适量的HILIC 填料㊂合适的填料与样品比例,可以保证较好的富集效果,减少吸附损失的影响,也可以防止样品过载㊂固定填料的用量,依次提高蛋白质的上样量,即选取样品与填料质量比为1∶1000,1∶500,1∶50,1∶10时对Fetuin 蛋白的酶切产物进行富集㊂对在洗脱组分和上样流出组分的糖肽信号进行分析,以3个糖肽中信号强度最高的N156位糖肽的去除糖链后肽段[M+H]+m /z 1741.8247(序列为LCPDCPLLAPLNDSR)的相对强度作为参照,结果如图2所示㊂在样品与填料质量比为1∶10,结合组分和流出组分中的糖肽 图2 不同HILIC 填料与糖蛋白样品的比例对富集效果的影响Fig.2 Relative intensity of glycopeptides under different reaction ratio between glycoprotein and HILIC material1.洗脱组分(Elution);2.流出组分(Flow through)㊂信号都最高,因此以该条件下的糖肽信号为100%,分别计算其它条件下结合组分和流出组分中的糖肽相对强度㊂当选取样品与填料质量比为1∶1000和1∶500时,虽然流出组分中未结合的糖肽比例低于20%,但洗脱组分中的糖肽信号也小于40%㊂当样品与填料质量比为1∶50时,结合组分中糖肽得到有效的富集,而流出组分中糖肽信号仍低于20%㊂样品与填料比例为1∶10时,上样流出组分中的糖肽相对信号大幅增加,表明此时糖肽已经过载㊂因此,在制作HILIC 小柱时,采用样品与填料质量比为1∶50时富集效果显著,并能得到较好的回收率㊂3.1.2 RNase B 完整糖肽制备与纯化 RNase B 经过Trypsin 酶切,在DHB 基质辅助下,得到糖肽和肽段混合物的一级质谱图,如图3a 所示㊂由于糖基化的微不均一性,核糖核苷酶B 的同一糖基化位点含有5个不同糖链长度的高甘露糖(Mannose,Man),即在化学计量水平,一个肽段的丰度被分散到5个糖肽上㊂对于相对含量较低的糖型,受到其它肽段的161第2期江静等:亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用 干扰更为严重,而不利于质谱的选择与检测㊂经过HILIC 小柱富集后,酶切产物中的非糖基化肽段被有效的去除,仅留下5个清晰的糖肽(图3b),为肽段序列SRNLTK 上分别连接Man5,Man6,Man7,Man8,Man9等不同长度的高甘露糖糖链㊂图3 (a)RNase B 酶切总肽段富集前的一级质谱图;(b)RNase B 肽段经亲水作用色谱柱富集后的一级质谱图(*:混合在总肽段中的糖肽)Fig.3 (a)Mass spectrum of peptides mixture from RNase B and (b)Mass spectrum of RNase B peptides after HILIC enrichment;(*:the glycopeptides)HILIC 亲水相互作用富集糖肽的方法,在保证分离效果和富集效率的同时保持了糖肽的完整性㊂洗脱液为5%乙腈⁃1%甲酸溶液,可以浓缩冻干,与质谱有很好的兼容性,为后续完整糖肽的质谱鉴定提供了良好的基础㊂3.2 多重碎裂方式互补,全面解析完整糖肽3.2.1 完整糖肽在经典CID 模式下的碎裂 碰撞诱导解离(CID)是生物质谱中肽段序列分析最为常用的碎裂模式,肽段活化碰撞后主要产生b㊁y 系碎片离子而得以解析序列㊂但糖基化修饰的糖链结构分子量较大,在CID 的能量碰撞下,糖肽不能充分碎裂㊂以肽段序列SRNLTK 上连接Man5的糖肽为例,其在电喷雾离子源中双电荷离子为[M+2H]2+m /z 967.93㊂由于糖苷键稳定性比酰胺键弱,在CID 条件下优先断裂,而形成糖肽上逐一丢失单糖的二级碎裂图谱㊂改变CID 的碎裂能量,从10%至50%㊂当CID 能量为20%,糖肽母离子开始碎裂,其最强的子离子占母离子相对丰度的70%,当CID 能量为30%时,母离子全部碎裂(图4)㊂继续提高能量至35%,40%,45%和50%,其碎裂情况基本不变㊂因 图4 母离子为[M+2H]2+m /z 967.93糖肽的CID 碎裂二级质谱图(方块为N⁃乙酰葡萄糖胺,圆圈为甘露糖)Fig.4 MS /MS spectrum of glycopeptide by collision⁃induced dissociation (CID)fragmentation,the precursorion [M +2H]2+m /z 967.93(squares,N ⁃acetylhexose⁃amine,HexNAc;circles,Hexose,Hex)此,CID 的碎裂谱图上难以得到肽段序列的信息,不能全面阐明完整糖肽的结构㊂3.2.2 完整糖肽在HCD 模式下碎裂能量的优化 在HCD 碰撞模式下,累积后的母离子将被注入HCD碰撞池中与中性氮气分子碰撞,碎裂后经C⁃Trap 送入Orbitrap 检测㊂此处仍然采用肽段序列SRNLTK上连接Man5的糖肽,m /z 967.93为检测对象㊂依次提高HCD 的碰撞能量,在20%能量下,糖肽的碎裂基本与CID 30%能量碎裂时一致㊂当HCD 能量为25%时,糖肽的谱图如图5所示㊂在低分子量区域,产生系列糖的特征离子,如m /z 204(HexNAc+H)+,m /z 366(HexNAc+Hex+H)+,以及氧鎓离子m /z 204(HexNAc+H)+继续碎裂而产生的碎片离子,例如m /z 126,138,168和186等㊂由于HCD 模式下不存在离子阱质谱仪CID 模式下的低质量端1/3质量丢失,使得上述糖碎片离子得以检测㊂在中高分子量区域,HCD 谱图得到一系列的逐一丢失单糖的Y系列碎片离子,各离子有1电荷与双电荷两种状态,故形成两组m /z 不同的离子峰㊂其中Y1(肽段+HexNAc+H)+离子峰m /z 921.45强度高,因此Y1离子和糖碎片氧鎓离子是显著的糖肽离子特征峰㊂261 分析化学第42卷图5 母离子为[M+2H]2+m /z 967.93糖肽的HCD 碎裂二级质谱图(方块为N ⁃乙酰葡萄,圆圈为甘露糖)㊂插图显示低质量端糖碎片离子Fig.5 MS /MS spectrum of glycopeptide by high energy collisional dissociation (HCD)fragmentation,the precur⁃sor ion [M+2H]2+m /z 967.93(squares,N ⁃acetylhexoseamine,HexNAc;circles,Hexose,Hex).Insert viewshowed the fragment ions of glycans in the low mass region 由图6可见,不同的HCD 碰撞能量下,糖肽的特征离子相对丰度各有不同㊂随着HCD 能量的增加,糖的特征碎片离子信号不断升高,其中可以继续碎裂的m /z 204与366离子在能量大于25%时开始降低㊂同时,双电荷状态下的Y 系列离子主要在20%~25%的中高能量下信号较高,随着能量的进一步加强,双电荷离子完全碎裂㊂1电荷的Y 碎片离子系列,在HCD 能量25%时达到高峰,但并不随能量的提高而继续增强㊂故采用HCD 能量为25%,对糖肽进行碰撞解离,其二级谱图可以得到最为充分的信息㊂图6 不同HCD 碎裂能量下,糖肽二级谱图中碎片离子的相对丰度:(a)糖的特征离子;(b)双电荷的Y 系列离子;(c)1电荷的Y 系列离子Fig.6 Relative intensity of glycopeptides′fragment ions in different HCD energy (a)carbohydrate⁃specific ions;(b)a series of Y ions doublely⁃charged;(c)a series of Y ions singlely⁃charged3.2.3 完整糖肽在ETD 碎裂中肽段序列分析 ETD 碎裂方式是将电子从一个活泼的阴离子基团转移到带正电荷的肽段上,从而诱发肽段序列碎裂产生c ㊁z 离子㊂由于ETD 的软碎裂模式,翻译后修饰的基团常得以保留,因此有利于准确识别修饰位点㊂如图7所示,m /z 967.93的Man5糖肽在ETD 谱图中,产生肽段骨架结构的碎片离子,从C3~C5及Z4~Z6两组离子中,得到该糖肽的肽段序列为SRN⁃LTK㊂从C2~C3及Z3~Z4之间,有大范围的质量跳跃,可以清晰指示糖基化位点㊂综上所述,CID 主要产生糖苷键断裂的碎片,为糖链的结构组成分析提供了线索;HCD 在低分子量361第2期江静等:亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用 图7 母离子为[M+2H]2+m /z 967.93糖肽的ETD 碎裂二级质谱图Fig.7 MS /MS spectrum of glycopeptide by electron transfer dissociation (ETD)fragmentation,the precursor ion[M+2H]2+m /z 967.93区域提供了糖链的特征离子信息,并产生明确的糖肽Y1特征离子,同时也产生部分糖苷键断裂的碎片,为糖链结构信息提供参考;ETD 保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂,可以提供有效的肽段序列信息㊂因此,联合CID㊁HCD㊁ETD 等多种碎裂方式,即可得到糖链结构㊁糖基化位点和肽段序列等糖蛋白质结构的全面信息㊂4 结 论本研究从解析完整糖肽水平入手,用自制HILIC 亲水相互作用小柱富集纯化样品中的糖肽并保持其完整性,采用LTQ⁃Orbitrap 质谱检测,联合CID㊁HCD㊁ETD 等多种碎裂方式分析糖肽结构㊂因此,本方法在有效富集糖肽的同时,获取了肽段序列以及糖基化位点信息,并且能够得到位点特异的糖型结构,为糖蛋白结构的进一步解析提供了一种简单㊁有效的方法㊂虽然不同碎裂条件下所获得的糖肽谱图均比较复杂,且糖链结构解析缺乏有效的数据库,规模化糖肽数据的解析还比较困难,但随着计算机自动化软件的进一步发展,亲水作用色谱联合多重碎裂方式的串联质谱方法将在糖蛋白质结构解析中发挥更大的作用㊂致谢 感谢波士顿大学医学院Catherine E.Costello 教授在糖肽ETD 分析中提供的帮助与指导㊂References 1 Ohtsubo K,Marth J D.Cell ,2006,126(5):855-8672 LU Zhuang,WANG Shan,DAI Jing⁃Quan,WANG Jing⁃Lan,ZHANG Yang⁃Jun,YING Wan⁃Tao,XU You⁃Xuan,QIAN Xiao⁃Hong,WU Mou⁃Tian,CAi Yun.Chinese J.Anal.Chem.,2006,34(5):591-597卢庄,王杉,代景泉,王京兰,张养军,应万涛,徐友宣,钱小红,吴侔天,蔡耘.分析化学,2006,34(5):591-5973 Rakus J F,Mahal L K.Annu.Rev.Anal.Chem.,2011,4:367-3924 Doerr A.Nature Methods ,2011,9(1):36-365 Wada Y,Azadi P,Costello C E,Dell A,Dwek R A,Geyer H,Geyer R,Kakehi K,Karlsson N G,Kato K,Kawasaki N,Khoo K H,Kim S,Kondo A,Lattova E,Mechref Y,Miyoshi E,Nakamura K,Narimatsu H,Novotny M V,Packer N H,Perreault H,Peter⁃Katalinic J,Pohlentz G,Reinhold V N,Rudd P M,Suzuki A,Taniguchi N.Glycobiology ,2007,17(4):411-4226 Pasing Y,Sickmann A,Lewandrowski U.Biol.Chem.,2012,393(4):249-2587 Nakano M,Nakagawa T,Ito T,Kitada T,Hijioka T,Kasahara A,Tajiri M,Wada Y,Taniguchi N,Miyoshi E.Int.J.Cancer ,2008,122(10):2301-23098 Zielinska D F,Gnad F,Wisniewski J R,Mann M.Cell ,2010,141(5):897-907461 分析化学第42卷9 Palmisano G,Lendal S E,Engholm⁃Keller K,Leth⁃Larsen R,Parker B L,Larsen M R.Nat Protoc ,2010,5(12):1974-198210 Zhang H,Li X J,Martin D B,Aebersold R,Aebersold R.Nat Biotechnol.,2003,21(6):660-66611 Zauner G,Deelder A M,Wuhrer M.Electrophoresis ,2011,32(24):3456-346612 Wiesner J,Premsler T,Sickmann A.Proteomics ,2008,8(21):4466-448313 Shen Y,Tolic N,Xie F,Zhao R,Purvine S O,Schepmoes A A,Moore R J,Anderson G A,Smith R D.J.Proteome Res.,2011,10(9):3929-3943Characterization of Intact Glycopeptides by a Combination of Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography and Multiple Fragmentation Tandem Mass SpectrometryJIANG Jing 1,2,YING Wan⁃Tao *2,QIAN Xiao⁃Hong *21(Chinese PLA General Hospital ,Chinese People′s Liberation Army Postgraduate Medical School ,Beijing 100039,China )2(State Key Laboratory of Proteomics ,Beijing Proteome Research Center ,Beijing Institute of Radiation Medicine ,Beijing 102206,China )Abstract Glycosylation of proteins plays a significant role in physiological and pathological processes.The general strategy to characterize the glycoprotein is to release the glycans from proteins,and then analyze them separately.However,the traditional methods suffer from inherent limitations since the relationship between proteins and glycans is neglected.Here we developed an integrated approach for intact glycopeptides analysis.Glycopeptides were first enriched selectively by home⁃made hydrophilic interaction liquid chromatography (HILC)tips,and then analyzed by mass spectrometry.We applied multiple fragmentation methods including collision⁃induced dissociation (CID ),high energy collisional dissociation (HCD )and electron transfer dissociation (ETD)for comprehensive characterization of glycosylation.The results showed that the best ratio of sample vs material for glycopeptide enrichment was 1∶50;CID with 35%collision energy cleaves glycosidic bonds,which was useful for glycan composition identification;HCD with 25%collision energy provided low mass diagnostic ions specific to glycan fragmentation,and also the specific Y1fragment ion of glycopeptide;ETD cleaved peptide backbone,yielded peptide sequence and helps to assign glycosites.This work indicates that HILIC enrichment and multiple fragmentation techniques may be an effective way to characterize glycopeptides for the simultaneous elucidation of peptide sequence,glycosite and glycan structures.Keywords Hydrophilic interaction liquid chromatography;Tandem mass spectrometry;Intact glycopeptides;Collision⁃induced dissociation;High energy collisional dissociation;Electron transfer dissociation (Received 7June 2013;accepted 5August 2013)This work was supported by the National High Technology Research and Development Program of China (No.2012AA020203)561第2期江静等:亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用 。
婴配乳粉中2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖含量离子色谱法检测
第41卷2024 年 3 月应用化学CHINESE JOURNAL OF APPLIED CHEMISTRY第3期405⁃414婴配乳粉中2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N -新四糖含量离子色谱法检测詹胜群 葛城* 周荣杰 周钧（澳优乳业（中国）有限公司， 长沙 410200）摘要 研究了离子色谱法同时测定婴配乳粉中2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N -新四糖的含量及影响因素。
采用离子色谱柱分离，脉冲安培检测器检测和外标法定量分析等方法。
通过对不同净化方式、酶解处理和洗脱条件等过程进行考察和优化，比较确定色谱条件和前处理条件对分离的影响，并就线性范围进行探讨。
结果表明，优化后的方法线性关系良好， R 2＞0.999； 方法精密度好， 相对标准偏差（n =7）＜2.7%； 方法准确度好，2′-岩藻糖基乳糖回收率为95.97%~103.38%，乳糖-N -新四糖回收率为100.09%~104.01%。
该方法能对婴配乳粉中的2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N -新四糖同时测定， 操作简单， 具有良好的准确度和精密度， 可为婴配乳粉质量监控方法提供参考。
关键词 母乳低聚糖；离子色谱；2′-岩藻糖基乳糖；乳糖-N -新四糖；婴配乳粉中图分类号：O657.7 文献标识码：A 文章编号：1000-0518（2024）03-0405-10母乳低聚糖（HMOs ）是一种多功能聚糖，是人乳中的第三大成分［1］，其结构主要由5种基本单糖组成： 葡萄糖（Glucose ， Glc ）、半乳糖（Galactose ， Gal ）、N -乙酰葡糖氨（Nacetylglucosamine ， GlcNAc ）、岩藻糖（Fucose ， Fuc ）和N -乙酰神经氨酸（N -Acetylneuraminic acid ， NeuAc ），通常由半乳糖和葡萄糖与其它一种或多种单糖聚合形成多种结构［2］。
HMOs 对于婴幼儿的生长健康有着重要的意义，除了可预防感染、过敏以外，还能促进肠胃发育、增强自身免疫、预防糖尿病和心血管疾病［3-5］等。
碰撞诱导解离和高能碰撞解离方式在褐藻胶寡糖结构分析中的比较和应用
碰撞诱导解离和高能碰撞解离方式在褐藻胶寡糖结构分析中的比较和应用宋妮;张秀丽;王聪;吕志华;任素梅【摘要】利用组合式高分辨质谱仪(LTQ Orbitrap XL)对均一褐藻胶寡糖,包括甘露糖醛酸寡糖和古洛糖醛酸寡糖进行二级质谱分析,比较了常规的碰撞诱导解离(CID)和高能碰撞解离(HCD)在寡糖结构分析中的差异,并应用HCD技术分析甘露糖醛酸寡糖和古洛糖醛酸寡糖的结构差异.研究发现,HCD可避免CID中的1/3效应,而且可以提供更多的糖环断裂碎片信息,如2.55A2 (m/z 291)、2.44A(m/z 235、411)、2,5A脱水(m/z 101、277、453)以及Z2脱羧碎片(m/z 307、483、659)等,进一步验证了Z2脱羧碎片是区别甘露糖醛酸与古洛糖醛酸的特征碎片.同时,HCD能够提供丰富的裂解碎片信息,这为褐藻胶寡糖的结构解析提供了依据.%Alginate homooligosaccharides including oligomannuronate (M) and oligoguluronate (G) with degree of polymerization from 2 to 7 were analyzed by linear ion trapOrbitrap mass spectrometer (LTQ Orbitrap XL) using collision induced dissociation (CID) and high energy collision induced dissociation (HCD).First of all,comparison of CID MS/MS and HCD MS/MS of either M or G was conducted.Taking the trimannuronate (M3) as an example,CID MS/MS showed the m/z 369,193 and 175 ions were assigned to C2/Y2,C1/Y1 and B1/Z1,respectively,which were formed due to single glycosidic bond cleavage,while HCD MS/MS caused cleavage of all glycosidic bonds and showed weak A-type ions,such as 0,2A (m/z309,485),2,5A (m/z 291,467) and 0,4A3 ions (m/z 471).Interestingly,an internal M produced a Zint-CO2 ions at m/z 307,which was unique andfound only in HCD MS/MS.Furthermore,CID MS/MS and HCD MS/MS ofM3 and triguluronate (G3) were executed.For CID,M3 and G3 did not show significant difference,and they gave identical glycosidic bond cleavage ions C1 (m/z 193),B1 (m/z 175) together with the dehydrated and decarboxylated ions (m/z 157 and m/z 131).These results suggest that it is impossible to differentiate the two residues at a nonreducing terminal of M3 and G3 by CID.However,a significant difference was observed in HCD spectra for M3 and G3.It was found that besides decarboxylation fragment m/z 307,debris 2,4A3 (m/z 411),2,5A3 (m/z 467) and 0,4A3 (m/z 471)were found in M3,whereas these ions were not found in HCD MS/MS of G3,thus demonstrating that HCD MS/MS can be used to differentiate M3 and G3.In the CID MS/MS of pentamannuronate (M5),fragment ions 0,2A3 (m/z 837),0,4A3 (m/z 823) and 2,5A3(m/z 819) was foundapparently,however,HCD displayed rich fragment ions in the low mass region,which should be ascribed to the characteristics of high-energy dissociation of HCD.For heptamannuronate (M7) and heptaguluronate (G7),doubly charged protonated species were collected as parent ions for CID and HCD.HCD MS/MS provided more fragment ions than CIDMS/MS,especially,Zint-CO2 ion (m/z 307,483,659,835 and 1 011) signal was apparently showed in M7 HCD spectra.Taken together,this work demonstrates that HCD MS/MS provides rich product ions and has no low mass cut off.The fragment ions in HCD spectra have high mass accuracy and resolution.These characteristics of HCD spectra complement thepower of CID and allow easy spectrametric interpretation and high confidence in structural elucidation for alginate oligosaccharides.【期刊名称】《质谱学报》【年(卷),期】2017(038)005【总页数】8页(P551-558)【关键词】组合式高分辨质谱仪(LTQ Orbitrap XL);褐藻胶寡糖;碰撞诱导解离(CID);高能碰撞解离(HCD)【作者】宋妮;张秀丽;王聪;吕志华;任素梅【作者单位】中国海洋大学医药学院,海洋药物教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学医药学院,海洋药物教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学医药学院,海洋药物教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学医药学院,海洋药物教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学医药学院,海洋药物教育部重点实验室,山东青岛266003【正文语种】中文【中图分类】O657.63Abstract: Alginate homooligosaccharides including oligomannuronate (M) and oligoguluronate (G) with degree of polymerization from 2 to 7 were analyzed by linear ion trap-Orbitrap mass spectrometer (LTQ Orbitrap XL) using collision induced dissociation (CID) and high energy collision induced dissociation (HCD). First of all, comparison of CID MS/MS and HCD MS/MS of either M or G was conducted. Taking the trimannuronate(M3) as an example, CID MS/MS showed the m/z 369, 193 and 175 ions were assigned to C2/Y2, C1/Y1 and B1/Z1, respectively, which were formed due to single glycosidic bond cleavage, while HCD MS/MS caused cleavage of all glycosidic bonds and showed weak A-type ions, such as 0,2A (m/z 309, 485), 2,5A (m/z 291, 467) and 0,4A3 ions (m/z 471). Interestingly, an internal M produced a Zint-CO2 ions at m/z 307, which was unique and found only in HCD MS/MS. Furthermore, CID MS/MS and HCD MS/MS of M3 and triguluronate (G3) were executed. For CID, M3 and G3 did not show significant difference, and they gave identical glycosidic bond cleavage ions C1 (m/z 193), B1 (m/z 175) together with the dehydrated and decarboxylated ions (m/z 157 and m/z 131). These results suggest that it is impossible to differentiate the two residues at a nonreducing terminal of M3 and G3 by CID. However, a significant difference was observed in HCD spectra for M3 and G3. It was found that besides decarboxylation fragment m/z 307, debris 2,4A3 (m/z 411), 2,5A3 (m/z 467) and 0,4A3 (m/z 471) were found in M3, whereas these ions were not found in HCD MS/MS of G3, thus demonstrating that HCD MS/MS can be used to differentiate M3 and G3. In the CID MS/MS of pentamannuronate (M5), fragment ions 0,2A3 (m/z 837), 0,4A3 (m/z 823) and 2,5A3 (m/z 819) was found apparently, however, HCD displayed rich fragment ions in the low mass region, which should be ascribed to the characteristics of high-energy dissociation of HCD. For heptamannuronate (M7) and heptaguluronate (G7), doubly charged protonated species were collected as parent ions for CID and HCD. HCD MS/MS provided morefragment ions than CID MS/MS, especially, Zint-CO2 ion (m/z 307, 483, 659, 835 and 1 011) signal was apparently showed in M7 HCD spectra. Taken together, this work demonstrates that HCD MS/MS provides rich product ions and has no low mass cut off. The fragment ions in HCD spectra have high mass accuracy and resolution. These characteristics of HCD spectra complement the power of CID and allow easy spectrametric interpretation and high confidence in structural elucidation for alginate oligosaccharides.Key words： linear ion trap-Orbitrap mass spectrometer (LTQ Orbitrap XL); alginate homooligosaccharides; collision induced dissociation (CID); high energy collision induced dissociation (HCD)褐藻胶是一种直链的多糖类化合物，结构单元是β-(1→4)连接的D-甘露糖醛酸(M)和α-(1→4)连接的L-古洛糖醛酸(G)，其在人类疾病、植物生长和抑菌等方面具有生物活性。
气相色谱-质谱联用同时分析新型细菌多糖中的单糖和糖醛酸
气相色谱-质谱联用同时分析新型细菌多糖中的单糖和糖醛酸王凤芹;杨航仙;汪以真【摘要】对纯化的新型细菌多糖进行酸水解,用乙硫醇-三氟乙酸和醋酐-吡啶体系先后对酸水解物进行衍生,与之前报道不同的是糖醛酸得到有效衍生化.以木糖为内标,采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)定量分析该多糖酸水解物中单糖和糖醛酸衍生物发现,该多糖的糖链由岩藻糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖组成,其相对物质的量比为1.50∶1.0∶0.79∶2.06;中性糖比例与糖醇乙酸酯化分析岩藻糖、葡萄糖和半乳糖的相对物质的量比(1.76∶1.0∶1.98)接近；糖醛酸咔唑法与该方法分析葡萄糖醛酸的含量分别为16.19％和14.85％.以上结果表明所建立的衍生化方法及GC-MS同时定量分析多糖酸水解物中单糖和糖醛酸的方法可行.此外还对葡萄糖醛酸的质谱裂解机理进行了阐述.%The purified novel bacterial polysaccharide was acid-hydrolyzed, followed by the subsequent derivatization using ethanethiol-trifluoroacetic acid and acetic anhydride-pyridine systems sequentially. Our findings differ from the previous reports in that the glucuronic acid was obtained through effective derivatization. The neutral sugars and glucuronic acid were analyzed using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) with xylose as an internal standard. The polysaccharide was found to be composed of fucose, glucose, glucuronic acid and galactose, with the relative molar ratio of 1. 50: 1. 0: 0. 79= 2. 06. The neutral sugars ratio was similar to the relative molar ratio for fucose, glucose and galactose of 1. 76: l. 0: 1. 98 through alditol acetates determined by GC. The percentages of glucuronic acid analyzed using either the carbazole and sulfuric acid method or the above method were16. 19% and 14. 85%, respectively. These results indicate that it is practicable to use the derivatization method and GC-MS to quantitatively analyze neutral sugars and glucuronic acid simultaneously in polysaccharide. For GC-MS analysis, the procedure was developed for the simultaneous determination of the derivatives in 25 min, and was performed using an HP-5MS column. Molecular ion peaks were observed in the electron ionization ( E1) mass spectra. The fragmentation mechanism for glucuronic acid derivative is discussed in detail.【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2013(031)001【总页数】6页(P53-58)【关键词】气相色谱-质谱联用;糖醛酸;衍生化;裂解机理;细菌多糖【作者】王凤芹;杨航仙;汪以真【作者单位】浙江大学饲料科学研究所,农业部华东动物营养与饲料重点实验室,浙江省饲料及动物营养研究实验室,浙江杭州310058;浙江大学饲料科学研究所,农业部华东动物营养与饲料重点实验室,浙江省饲料及动物营养研究实验室,浙江杭州310058;浙江大学饲料科学研究所,农业部华东动物营养与饲料重点实验室,浙江省饲料及动物营养研究实验室,浙江杭州310058【正文语种】中文【中图分类】O658在多糖的结构研究中，单糖组成分析是必不可少的环节。
基于精确质量数筛选的亲水作用色谱_高分辨质谱法快速鉴别赤潮藻中的麻痹性贝毒素
龙源期刊网 基于精确质量数筛选的亲水作用色谱高分辨质谱法快速鉴别赤潮藻中的麻痹性贝毒素作者：王小如等来源：《分析化学》2013年第07期摘要：采用亲水作用色谱高分辨电喷雾质谱联用技术（HILICHRESI/MS）结合麻痹性贝毒素（PSP）精确质量数数据库，建立快速筛查、定性识别赤潮藻中各种常见PSP的方法。
产毒藻细胞破碎后经0.1 mol/L 乙酸溶液提取，通过HILICHRESI/MS正负离子模式全扫描分析，得到产毒藻粗提物中PSP化合物准分子离子及主要碎片离子精确质量数，结合PSP数据库筛查并辅以商品化软件数据分析，实现产毒藻所含PSP的快速定性识别。
所建数据库包含25种常见PSP化合物精确分子质量及碎片离子信息，所发展的HILICHRESI/MS方法分离度高、灵敏度好，所考察的10种常见PSP化合物检测限在10～80 nmol/L范围内，能满足产毒藻实际样品的分析要求。
3种产毒藻实际样品筛查、分析结果良好，说明本方法是赤潮藻中麻痹性贝毒素快速筛选、定性识别的有效方法。
1引言近年来，随着海洋环境污染日益加重，赤潮发生频率日趋增大，由赤潮毒素致人类中毒和死亡事件屡见不鲜[1]。
根据中毒症状及毒素传递媒介的类型，赤潮毒素分为麻痹性贝毒（PSP）、腹泻性贝毒（DSP）、神经性贝毒（NSP）、记忆缺失性贝毒（ASP）和西加鱼毒（CFP）等[2]。
由于赤潮毒素种类多，且每一类毒素包含几十种甚至上百种毒素单体（不同单体之间毒性差异很大），因此，赤潮发生以后，海洋环境管理部门快速确定是否是产毒赤潮，产生何种毒素，就成为赤潮灾害应急管理的首要任务。
目前，主要采用形态学方法[3]，通过鉴别赤潮藻的种类来判断赤潮的产毒性质，然而，产毒赤潮藻种类繁多，即使是同一类产毒藻，在不同海域、不同生长条件下产毒量和产毒种类也会发生巨大变化，因此，急需发展赤潮藻中毒素快速筛选和鉴别的高效方法。
亲水作用色谱法测定纽莫康定B0及其杂质的研究
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亲水作用色谱在糖类化合物分析中的应用
亲水作用色谱在糖类化合物分析中的应用蒲江华;赵峡;韩文伟;白明月【摘要】The analysis of carbohydrate structure and composition plays a vital role in the study of structure-activity relationship of carbohydrates.Hydrophilic interaction chromatography (HILIC) could be used to separate polar compounds like carbohydrates with satisfactory resolution.The stationary phase and retention mechanism of HILIC column commonly used in carbohydrates analysis were introduced.The effects of strong elution solvent ratio,mobile phase pH value,buffer salt concentration and column temperature on separation were also discussed.Application examples in analysis of monosaccharide composition,disaccharide composition ofglycosaminoglycans,polymerization degree ofoligosaccharides,glycosides,glycolipids,sugar alcohols and N-/O-glycans by HILIC were illustrated in this paper.%糖类化合物的结构和组成分析对于探究糖的结构与功能的关系具有重要作用.亲水作用色谱(HIL-IC)对糖类等极性化合物具有良好的分离效果.该文介绍了适合糖类分析的常用HILIC柱固定相及其分离机制,论述了强洗脱溶剂比例、流动相pH值、缓冲盐浓度和色谱柱温度对HILIC分离效果的影响,并举例说明了HILIC法在单糖组成、糖胺聚糖二糖组成、寡糖聚合度、糖苷、糖脂、糖醇以及N-/O-糖链分析中的应用.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2017(036)001【总页数】6页(P145-150)【关键词】亲水作用色谱;固定相;保留机制;糖类分析;综述【作者】蒲江华;赵峡;韩文伟;白明月【作者单位】中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室,山东省糖科学与糖工程重点实验室,医药学院,山东青岛266003;中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室,山东省糖科学与糖工程重点实验室,医药学院,山东青岛266003;中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室,山东省糖科学与糖工程重点实验室,医药学院,山东青岛266003;中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室,山东省糖科学与糖工程重点实验室,医药学院,山东青岛266003【正文语种】中文【中图分类】O657.7;O629.1糖及其复合物的分析检测在医学、药学、生物学等领域均具有重要作用。
亲水相互作用色谱-串联质谱法测定液体食品中14种甜味剂
亲水相互作用色谱-串联质谱法测定液体食品中14种甜味剂范广宇;冯峰;张峰;高飞;李晓明;梁振纲【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2018(36)4【摘要】建立了亲水相互作用色谱-三重四极杆质谱(HILIC-MS/MS)同时测定液体食品中6种人工合成甜味剂和8种甜菊糖苷类天然甜味剂的分析方法.样品经Waters Xbridge Amide色谱柱(150 mm×5.0 mm,3.5 μm)分离,以乙腈-10 mmol/L甲酸铵溶液(65:35,v/v)为流动相,流速为0.4 mL/min,柱温为35 ℃,然后以电喷雾电离(ESI)源,在多反应监测(MRM)、负离子模式下进行三重四极杆质谱检测.14种甜味剂在各自的范围内线性关系良好,相关系数均大于0.995,检出限为0.03~0.7 mg/kg,定量限为0.1~2.2 mg/kg.在2、5和20 mg/kg添加水平下,14种甜味剂的平均回收率为80.8%~108.7%,相对标准偏差为1.5%~7.7%(n=6).该方法样品前处理操作简单,准确度高,灵敏度高,可用于液体食品中14种甜味剂的同时测定.%A method for the simultaneous determination of six artificial sweeteners and eight steviol glycosides in liquid food samples by hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HILIC-MS/MS)was developed. The sweeteners in the samples were separated by a Waters Xbridge Amide column(150 mm×5.0 mm,3.5 μm)at 35 ℃,and eluted with acetonitrile-10 mmol/L ammoniumformate(65 :35,v/v)at a flow rate of 0.4 mL/min. Then,the analytes were detected using an electrospray ion source in negative mode (ESI-)under multiple reaction monitoring(MRM)mode. Good linear relationships wereobtained,and the correlation coefficients(r2)of the 14 sweeteners were greater than 0.995. The limits of detection(LODs,S/N=3)and the limits of quantification(LOQs,S/N=10) ranged from 0.03 to 0.7 mg/kg and 0.1 to 2.2 mg/kg,respectively. The average recoveries varied from 80.8% to 108.7% at spiked levels of 2,5 and 20 mg/kg,and the relative standarddeviations(RSDs)ranged from 1.5% to 7.7%(n=6). The proposed method is simple,accurate and sensitive for the simultaneous determination of the 14 sweeteners in liquid food samples.【总页数】5页(P351-355)【作者】范广宇;冯峰;张峰;高飞;李晓明;梁振纲【作者单位】中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,北京100176;连云港出入境检验检疫局,江苏连云港222042;中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,北京100176;中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,北京100176;中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,北京100176;济南出入境检验检疫局,山东济南250014;海南出入境检验检疫局技术中心,海南海口570311【正文语种】中文【中图分类】O658【相关文献】1.亲水相互作用色谱-串联质谱法同时测定动物组织中金刚烷胺与利巴韦林 [J], 邵琳智;姚仰勋;谢敏玲;林峰2.亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用 [J], 江静;应万涛;钱小红3.超高效液相色谱结合亲水相互作用色谱法测定普鲁卡因青霉素注射液中普鲁卡因和青霉素的含量 [J], 吴剑平; 姜芹; 王博; 严凤; 张文刚; 黄士新4.亲水相互作用色谱-串联质谱法测定饮用水中的4种甜味剂 [J], 刘向凌;刘洪忠;王鹏坤;马斐5.亲水相互作用色谱-串联质谱法快速测定葡萄酒中四种花青素 [J], 夏碧琪;黄芙珍;陈祥准;程洁;沈燕;韩超因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
亲水性液相色谱串联质谱法测定红甜菜中甜菜碱含量的检测方法[发明专利]
![亲水性液相色谱串联质谱法测定红甜菜中甜菜碱含量的检测方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/6026c8aaa8956bec0875e3cd.png)
专利名称：亲水性液相色谱串联质谱法测定红甜菜中甜菜碱含量的检测方法
专利类型：发明专利
发明人：吴玉梅,周芹,刘乃新
申请号：CN201811167848.8
申请日：20181008
公开号：CN109030665A
公开日：
20181218
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种红甜菜中甜菜碱含量的检测方法，其通过采用亲水性液相色谱串联质谱法测定，该方法包括：配置已知浓度的甜菜碱标准品储备液；将标准储备液用超纯水稀释成不同浓度的标准溶液系列，而后分别注入到液相色谱‑串联质谱中进行检测得到标准曲线或回归方程；称取糊状的甜菜糊样品，加入硅藻土，萃取后处理得到提取液，并过0.22μm滤膜等处理后得到检测液；最后通过UPLC‑MS/MS检测并结合标准曲线或回归方程得到甜菜碱含量。
本发明的检测方式采用改进的方法结合亲水性液相色谱串联质谱技术，建立了红甜菜中甜菜碱的定量分析方法，其与传统的分析方法相比，具有检出限低、灵敏度高的优点，完全可以适用于甜菜中甜菜碱的分析检测。
申请人：黑龙江大学
地址：150000 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路74号
国籍：CN
代理机构：无锡市汇诚永信专利代理事务所(普通合伙)
代理人：王闯
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亲水作用色谱-电雾式检测用于5种抗病毒药物的定量分析
亲水作用色谱-电雾式检测用于5种抗病毒药物的定量分析龙珍;金燕;刘晓达;郭志谋;沈爱金;胡兴娟;吴宁鹏【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2015(33)9【摘要】抗病毒药物具有广泛的应用，对人类和动物的健康有着重要的作用。
但抗病毒药物紫外吸收差异大、极性分布广，要实现该类药物的同时分析较为困难。
本实验以Click TE⁃Cys为固定相，结合电雾式检测（ CAD），建立了多种抗病毒药物同时分离分析的方法。
考察了不同的检测器、色谱模式、色谱柱和流动相对抗病毒药物峰形、分离选择性及检测信号响应的影响。
在优化的条件下定量分析了5种抗病毒药物，结果证明该方法具有较好的日内重复性（RSD≤3�06％）和日间重复性（RSD≤5�38％）。
同时，该方法还具有较宽的线性范围（0�07～2�28 mg／mL）和较高的灵敏度（LOQ≤0�04 mg／mL），可用于相关药物的定量、定性分析。
%Antiviral drugs are widely used for human and animals. However, the analysis of the mixture of antiviral drugs is a challenge for high performance liquid chromatography, since some of the antiviral drugs have weak UV absorbance and poor retention in reversed phase liq⁃uid chromatography. A method of hydrophilic interaction liquid chromatography⁃charged aerosol detection ( HILIC⁃CAD) was optimized for the qualitative and quantitative analysis of five antivi⁃ral drugs. In this study, Click TE⁃Cys was used as the stationary phase and CAD was used as the detector. Various chromatographic conditions including the kind of detector, chromato⁃graphic mode, column and mobile phase compositionwere investigated. Compared to UV⁃Vis, more antiviral drugs could be detected by CAD, since it is a universal detector. HILIC mode is an alternative to reversed phase liquid chromatography mode. HILIC provides higher sensitivity and unique selectivity to target compounds. After the optimized parameters were obtained, the developed method was used for the quantitative analysis of the five antiviral drugs. As a result, the current method has good repeatability, a wide linear range (0�07-2�28 mg/mL) and good sensitivity ( LOQ≤0�04 mg/mL) . The RSDs of intra⁃day and inter⁃day peak areas were less than 3�06% and 5�38% respectively. The above results demonstrated that the current method is sen⁃sitive, robust and effective for the separation and determination of these five antiviral drugs.【总页数】5页(P938-942)【作者】龙珍;金燕;刘晓达;郭志谋;沈爱金;胡兴娟;吴宁鹏【作者单位】赛默飞世尔中国科技有限公司，北京100080;赛默飞世尔中国科技有限公司，北京100080;赛默飞世尔中国科技有限公司，北京100080;中国科学院分离分析化学重点实验室，中国科学院大连化学物理研究所，辽宁大连116023;中国科学院分离分析化学重点实验室，中国科学院大连化学物理研究所，辽宁大连116023;河南省兽药饲料监察所，河南郑州450008;河南省兽药饲料监察所，河南郑州450008【正文语种】中文【中图分类】O658【相关文献】1.亲水作用色谱与电雾式检测器测定枸杞子药材中的甜菜碱 [J], 张敏利;金燕2.亲水作用加压毛细管电色谱-激光诱导荧光检测法分析痕量核黄素类物质 [J], 吴翊民;吴庆政;王晓春;谢增鸿;吴晓苹3.亲水作用毛细管整体柱的制备及其用于奶制品中三聚氰胺的加压毛细管电色谱分析 [J], 李新燕;王彦;谷雪;陈妍;阎超4.分散固相萃取结合亲水作用色谱-串联质谱法检测预混合饲料中7种抗病毒药物含量 [J], 吴剑平;张鑫;李丹妮;严凤;潘娟;张婧5.高效亲水作用色谱-蒸发光散检测应用于甘油磷酸胆碱含量测定 [J], 娄良因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基于部分酸水解-亲水作用色谱-质谱的黄芪多糖结构表征
２０１４年１２月Ｖｏｌ．３２Ｎｏ．１２Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０１４ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ１３０６ １３１２研究论文ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０１４．０８０２３∗通讯联系人．Ｔｅｌ：（０２１）６４２５０６３３，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉａｎｇｘｍ＠ｅｃｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ．基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金项目（２０１３００７４１２００１７）；中国博士后科学基金面上项目（２０１３Ｍ５４１４８１）．收稿日期：２０１４⁃０８⁃２５基于部分酸水解⁃亲水作用色谱⁃质谱的黄芪多糖结构表征梁㊀图１，㊀傅㊀青１，㊀辛华夏１，㊀李芳冰１，㊀金㊀郁１，㊀梁鑫淼１，２∗（１．华东理工大学药学院，上海２００２３７；２．中国科学院大连化学物理研究所，辽宁大连１１６０２３）摘要：来自中药的水溶性多糖具有广谱治疗和低毒性特点，是天然药物及保健品研发中的重要组成部分㊂针对中药多糖结构复杂㊁难以表征的问题，本文以中药黄芪中的多糖为研究对象，采用 自下而上 法完成对黄芪多糖的表征㊂首先使用部分酸水解方法水解黄芪多糖，分别考察了水解时间㊁酸浓度和温度的影响㊂在适宜条件（４ｈ㊁１ ５ｍｏｌ／Ｌ三氟乙酸㊁８０ħ）下，黄芪多糖被水解为特征性的寡糖片段㊂接下来，采用亲水作用色谱与质谱联用对黄芪多糖部分酸水解产物进行分离和结构表征㊂结果表明，提取得到的黄芪多糖主要为１ң４连接线性葡聚糖，水解得到聚合度４ １１的葡寡糖㊂本研究对其他中药多糖的表征具有一定的示范作用㊂关键词：部分酸水解；亲水作用色谱；质谱；多糖；黄芪；表征中图分类号：Ｏ６５８㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀文章编号：１０００⁃８７１３（２０１４）１２⁃１３０６⁃０７ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｕｓｉｎｇｐａｒｔｉａｌａｃｉｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ⁃ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ⁃ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙＬＩＡＮＧＴｕ１，ＦＵＱｉｎｇ１，ＸＩＮＨｕａｘｉａ１，ＬＩＦａｎｇｂｉｎｇ１，ＪＩＮＹｕ１，ＬＩＡＮＧＸｉｎｍｉａｏ１，２∗（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＥａｓｔＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３７，Ｃｈｉｎａ；２．ＤａｌｉａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＰｈｙｓｉｃｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄａｌｉａｎ１１６０２３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗａｔｅｒ⁃ｓｏｌｕｂｌｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＴＣＭ）ｈａｖｅｐｒｏｐ⁃ｅｒｔｉｅｓｏｆｂｒｏａｄ⁃ｓｐｅｃｔｒｕｍｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｌｏｗｔｏｘｉｃｉｔｙ，ｍａｋｉｎｇｔｈｅｍａｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｉｎｎａｔｕｒａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｓａｎｄｈｅａｌｔｈｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｓｏｌｖｅｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｃｈａｒａｃ⁃ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｉｒｃｏｍｐｌｅｘｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａ ｂｏｔｔｏｍ⁃ｕｐ 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５ｍｏｌ／Ｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，ａｎｄ８０ħ），Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｗｅｒｅｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｔｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒａｇ⁃ｍｅｎｔｓ．Ａｔｌａｓｔ，ａｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ⁃ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｇｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｗｅｒｅｍａｉｎｌｙ１ң４ｌｉｎｅａｒｇｌｕｃａｎ，ａｎｄｇｌｕｃｏ⁃ｏｌｉｇｏｓａｃ⁃ｃｈａｒｉｄｅｓｗｉｔｈｔｈｅｄｅｇｒｅｅｓｏｆｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ＤＰ）ｏｆ４－１１ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｆｔｅｒｐａｒｔｉａｌａｃｉｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．ＴｈｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｉｓｔｈａｔｉｔｉｓｔｈｅｇｕｉｄａｎｃｅｆｏｒｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｏｔｈｅｒＴＣＭｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐａｒｔｉａｌａｃｉｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＩＬＩＣ）；㊀第１２期梁㊀图，等：基于部分酸水解⁃亲水作用色谱⁃质谱的黄芪多糖结构表征ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＳ）；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ；ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ㊀㊀糖类化合物是能量的主要来源，除了提供能量，研究发现糖类化合物在人生命过程中发挥着至关重要的作用，对人体生理活动产生各种影响㊂因此，以糖类化合物为基础的糖类药物成了制药公司和生物技术公司长期关注的焦点㊂多糖是糖类化合物的一种，在过去的几十年中，植物性多糖特别是来自中药的水溶性多糖，由于其具有广谱治疗和低毒性特点，引起了广泛关注㊂从人参㊁三七㊁黄芪㊁冬虫夏草㊁当归㊁灵芝等中药中提取的多糖具有免疫调节㊁抗肿瘤㊁抗氧化㊁抗病毒㊁抗炎等生物活性，使之成为天然药物及保健品研发中的重要组成部分㊂虽然有不少的中药多糖已应用于临床，但由于其化学组成不明确，质量很难控制，造成药效重复性较差，不符合国际规范，因而也难以在医药领域占主要地位㊂为了使国际社会更加广泛地接受多糖药物在 自然疗法 方面的价值，需要发展简单而可靠的分析方法用于中药多糖的表征㊂然而，多糖结构复杂且相对分子质量巨大，其表征是一个大的挑战㊂㊀㊀由于多糖的活性与多糖的相对分子质量㊁单糖组成㊁构型㊁糖苷键位置及三级结构相关，所以可使用色谱及光谱学方法检测中药多糖的结构特点，对其进行表征［１］㊂虽然获取结构信息是明确表征多糖的有效手段，但这个过程需要耗费大量精力，同时需要数量较多的多糖纯品，过程复杂㊁困难和耗时㊂在多糖分析中常使用蒽酮⁃硫酸法或苯酚⁃硫酸法等测定多糖含量，也可作为多糖表征的方法之一，多糖含量的变化可反映出不同产地㊁不同采收时期㊁不同栽培环境等方面的差异［２－４］㊂但该方法的选择性较差，不能有效鉴别出多糖制品中的一些掺假品［５］；同时，该方法也无法直观反映出多糖中糖单元组成㊁个数和比例分布等方面的信息㊂因此有必要发展新的方法用于中药多糖的表征㊂㊀㊀受蛋白质组学研究启发，可采用 自下而上 法完成对中药多糖的表征㊂先将中药多糖降解为特征性的寡糖片段，然后使用色谱以及色谱⁃质谱联用方法完成对特征性寡糖片段的分离和表征研究㊂酸水解是多糖降解中常用的方法之一，方法简单，易操作［６，７］㊂和酶解法相比，酸水解更加高效和快速［８］㊂由于酸水解过程一般与底物的结构无关，水解产物的聚合度仅与酸浓度和反应时间相关，因此具有普适性的特点，已被广泛用于多种多糖的降解，如壳聚糖［９］㊁木聚糖［１０］和南瓜多糖［１１］等㊂酸水解的目的是要获得充足数量的多糖降解碎片，因此要对部分酸水解的过程进行深入研究，考察酸水解的影响因素（包括酸浓度㊁水解温度和时间等），严格控制水解程度，保证重复㊁稳定地得到特征性的寡糖片段㊂㊀㊀对于得到的多个特征性寡糖片段，需要采用合适的方法对其进行分离分析㊂而糖类化合物的分离和检测，也是糖学研究的难点问题之一㊂糖类化合物结构中包含大量的羟基，极性大，在传统的反相液相色谱固定相上很难保留，往往在死时间就被洗脱下来，难以得到有效分离㊂所以大多数的反相液相色谱法都需要使用衍生试剂对糖类化合物进行衍生，以增加其在反相色谱柱上的保留和提高检测灵敏度［１２］㊂衍生步骤无疑增加了实验时间和方法的复杂程度㊂高效阴离子交换色谱⁃脉冲安培检测法适用于糖类化合物的直接分析［１３］㊂但该方法使用高浓度㊁高ｐＨ的非挥发性钠盐，对系统要求较高，并且不能直接与质谱联用㊂此外，研究发现亲水作用色谱（ＨＩＬＩＣ）适合用于糖类化合物的分离［１４－１６］㊂ＨＩＬＩＣ使用极性分离材料为固定相，水溶性有机溶剂为流动相，克服了传统反相色谱对糖类化合物保留不足的弱点㊂同时，ＨＩＬＩＣ方法使用高比例的有机溶剂和挥发性的缓冲盐，与质谱有好的兼容性，解决了离子交换色谱不能与质谱直接联用的问题㊂㊀㊀本文选择中药黄芪为研究对象，发展基于部分酸水解⁃亲水作用色谱的黄芪多糖表征方法㊂首先对影响黄芪多糖部分酸水解的各种因素进行优化，建立黄芪多糖部分酸水解方法，得到特征性的寡糖片段；然后使用亲水作用色谱方法与质谱方法联用对黄芪特征寡糖片段进行分离和结构表征，获取黄芪多糖组成㊁连接等结构信息㊂１㊀实验部分１．１㊀仪器、试剂与材料㊀㊀黄芪饮片购自上海雷允上药业有限公司，三氟乙酸（ＴＦＡ，纯度ȡ９９％）购自百灵威（中国）公司，无水乙醇㊁丙酮和石油醚购自国药化学试剂有限公司㊂实验用水来自Ｍｉｌｌｉ⁃Ｑ水纯化系统（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＵＳＡ），乙腈（色谱纯）购自Ｆｉｓｈｅｒ（ＦａｉｒＬａｗｎ，ＵＳＡ），甲酸（色谱纯）购自Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，德国）㊂㊀㊀色谱：Ｗａｔｅｒｓ高效液相色谱系统，包括Ｗａｔｅｒｓ２６９５ＨＰＬＣ泵㊁Ｗａｔｅｒｓ２４２０蒸发光散射检测器（ＥＬＳＤ），数据记录使用Ｅｍｐｏｗｅｒ工作站软件㊂㊀㊀质谱：ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＬＣＱＦｌｅｅｔ质谱仪（Ｔｈｅｒｍｏ，美国），配有电喷雾离子源（ＥＳＩ），工作站㊃７０３１㊃色谱第３２卷为Ｘｃａｌｉｂｕｒ２ １（Ｔｈｅｒｍｏ，美国）㊂图１㊀黄芪多糖提取流程Ｆｉｇ．１㊀Ｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ１．２㊀多糖提取㊀㊀如图１所示，取２０ｇ黄芪饮片，粉碎后加水热浸提，滤液浓缩㊁醇沉㊁过滤，滤饼洗涤后得到黄芪多糖，干燥，备用㊂１．３㊀多糖部分酸水解条件㊀㊀称取１０ｍｇ黄芪多糖，放入封管中，分别考察水解温度㊁时间及酸浓度的影响㊂㊀㊀水解时间：三氟乙酸浓度为１ ５ｍｏｌ／Ｌ，水解温度为８０ħ，水解时间分别为２㊁３㊁４和５ｈ，水解后氮气吹干，用１ｍＬ乙腈／水（５０ʒ５０，ｖ／ｖ）溶解，ＨＩＬＩＣ⁃ＥＬＳＤ分析㊂㊀㊀酸浓度：水解温度为８０ħ，水解时间为４ｈ，三氟乙酸浓度分别为０ ５㊁１ ０㊁１ ５和２ ０ｍｏｌ／Ｌ，水解后氮气吹干，用１ｍＬ乙腈／水（５０ʒ５０，ｖ／ｖ）溶解，ＨＩＬＩＣ⁃ＥＬＳＤ分析㊂㊀㊀水解温度：三氟乙酸浓度为１ ５ｍｏｌ／Ｌ，水解时间为４ｈ，水解温度分别为４０㊁６０㊁８０和１００ħ，水解后氮气吹干，用１ｍＬ乙腈／水（５０ʒ５０，ｖ／ｖ）溶解，ＨＩＬＩＣ⁃ＥＬＳＤ分析㊂㊀㊀最终，黄芪多糖部分酸水解的适宜条件是水解温度８０ħ，三氟乙酸浓度１ ５ｍｏｌ／Ｌ，水解时间４ｈ㊂１．４㊀分析条件㊀㊀色谱柱：ＣｌｉｃｋＸＩｏｎ（１５０ｍｍˑ４ ６ｍｍ，５μｍ，华谱新创科技有限公司）㊂㊀㊀酸水解产物分析条件：流动相Ａ为Ｈ２Ｏ，Ｂ为乙腈；洗脱梯度：０ ４０ｍｉｎ，８５％Ｂ ５０％Ｂ；流速：１ ０ｍＬ／ｍｉｎ㊂ＥＬＳＤ检测参数：氮气压力２ ０７ˑ１０５Ｐａ，漂移管温度５０ħ，增益值１００㊂㊀㊀ＨＩＬＩＣ⁃ＭＳ联用条件：流动相Ａ为Ｈ２Ｏ，Ｂ为乙腈㊂洗脱梯度：０ ４０ｍｉｎ，８５％Ｂ ６５％Ｂ；４０ ６０ｍｉｎ，６５％Ｂ㊂流速：１ ０ｍＬ／ｍｉｎ，柱后分流比为１ʒ４㊂ＥＳＩ离子源接口，正离子模式一级全扫描，质量扫描范围为ｍ／ｚ１５０ ２０００㊂脱溶剂气为氮气，离子传输毛细管温度为３００ħ，鞘气流速为３５ａｒｂ，辅助气流速为６ａｒｂ，喷雾电压为５ ００ｋＶ，毛细管电压为３０Ｖ㊂ＭＳｎ条件下分析时，毛细管传输能量为１５ ２５Ｖ㊂２㊀结果与讨论２．１㊀黄芪多糖部分酸水解方法的建立㊀㊀使用 水提醇沉 法对黄芪饮片进行处理，得到黄芪多糖，具体处理步骤如图１所示㊂为了得到特征性的寡糖片段，对影响水解过程的各种因素进行了研究，具体包括水解温度㊁时间和酸浓度㊂㊀㊀首先考察水解时间对黄芪多糖降解程度的影响㊂水解后的多糖采用亲水作用色谱⁃蒸发光散射检测（ＨＩＬＩＣ⁃ＥＬＳＤ）方法对其进行分析，结果如图２所示㊂ＨＩＬＩＣ模式下，黄芪寡糖在ＣｌｉｃｋＸＩｏｎ色谱柱上得到了较好的分离，按照极性由小到大的顺序依次被洗脱，最后的 大包峰 是未水解的黄芪多糖㊂当水解时间为２ ３ｈ时，黄芪多糖水解不够充分，大部分以多糖形式存在，寡糖含量较低；当水解时间增加至４ｈ时，大部分的多糖开始水解，寡糖含量明显增加；水解时间进一步增加至５ｈ时，谱图没有明显变化，由此推测，水解时间超过４ｈ后再继续增加水解时间，对黄芪多糖的水解程度不再产生大的影响㊂所以４ｈ为黄芪多糖水解的适宜时间㊂㊀㊀接下来考察酸浓度对黄芪多糖降解程度的影响，结果如图３所示㊂当三氟乙酸浓度为０ ５ｍｏｌ／Ｌ时，水解不明显，大部分以多糖的形式存在；三氟乙酸浓度为１ ０ｍｏｌ／Ｌ时，多糖水解速度加快，㊃８０３１㊃㊀第１２期梁㊀图，等：基于部分酸水解⁃亲水作用色谱⁃质谱的黄芪多糖结构表征图２㊀水解时间对黄芪多糖部分酸水解的影响Ｆｉｇ．２㊀ＥｆｆｅｃｔｏｆｔｉｍｅｏｎｔｈｅｐａｒｔｉａｌａｃｉｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ寡糖含量明显增加；当酸浓度增加至１ ５ｍｏｌ／Ｌ时，大部分的黄芪多糖水解为寡糖；继续增加三氟乙酸浓度，谱图不再有明显变化㊂因此，确定黄芪多糖水解的适宜酸浓度为１ ５ｍｏｌ／Ｌ㊂㊀㊀最后，考察水解温度对黄芪多糖降解程度的影响，结果如图４所示㊂温度的变化对黄芪多糖水解程度的影响非常明显，４０ħ和６０ħ时，由于温度过低，黄芪多糖几乎不发生水解；当温度升高到８０ħ时，黄芪多糖迅速水解为寡糖，寡糖含量大幅度增加；当温度进一步升高时，黄芪多糖水解程度加剧，几乎全部水解为单糖和聚合度较小的寡糖㊂由此可见，多糖水解程度对温度的变化非常敏感，温度调节对控制多糖水解程度非常重要㊂所以，８０ħ为黄芪多糖水解的适宜温度，该温度下黄芪多糖水解程度适中，可产生大量特征性的寡糖片段㊂２．２㊀黄芪多糖ＨＩＬＩＣ⁃ＭＳ表征方法的建立㊀㊀黄芪多糖经过酸水解后得到大量的寡糖片段，采用ＨＩＬＩＣ⁃ＭＳ方法在正离子模式下对特征性寡糖片段进行分析，总离子流图如图５所示㊂对图５中色谱峰的质谱图进行分析发现，２９ｍｉｎ前为杂质峰，包括单糖㊁二糖以及黄芪提取物中的非糖杂质成分㊂如表１所示，对２９ｍｉｎ后的主要色谱峰１ ８做图３㊀ＴＦＡ浓度对黄芪多糖部分酸水解的影响Ｆｉｇ．３㊀ＥｆｆｅｃｔｏｆＴＦＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｐａｒｔｉａｌａｃｉｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ图４㊀温度对黄芪多糖部分酸水解的影响Ｆｉｇ．４㊀ＥｆｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅｐａｒｔｉａｌａｃｉｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ㊃９０３１㊃色谱第３２卷图５㊀黄芪多糖在正离子模式下的总离子流色谱图Ｆｉｇ．５㊀ＴｏｔａｌｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎｐｏｓｉｔｉｖｅｍｏｄｅ表１㊀图５中色谱峰１ ８的一级质谱数据Ｔａｂｌｅ１㊀ＤａｔａｆｏｒｔｈｅＭＳｓｐｅｃｔｒａｏｆｐｅａｋｓ１－８ｉｎＦｉｇ．５ＰｅａｋＲｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ／ｍｉｎ［Ｍ＋Ｈ］＋（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｎａ］＋（ｍ／ｚ）ＤＰ１２９．５６６７６８９４２３７．５８２９８５１５３３８．１９９１１０１３６４４０．８１１５３１１７５７５４３．９１３１５１３３７８６４７．５１４７７１４９９９７５１．８１６３９１６６１１０８５７．０１８０１１８２３１１进一步分析㊂其一级质谱中糖类化合物在正离子模式下易产生［Ｍ＋Ｎａ］＋和［Ｍ＋Ｈ］＋离子，色谱峰１ ８对应的相对分子质量依次为６６６㊁８２８㊁９９０㊁１１５２㊁１３１４㊁１４７６㊁１６３８和１８００㊂结合文献［１７，１８］报道判断，色谱峰１ ８为聚合度（ＤＰ）４ １１的中性葡寡糖㊂即本文提取得到的黄芪多糖主要为葡聚糖，被水解为ＤＰ４ １１的葡寡糖㊂㊀㊀对色谱峰１ ８做二级质谱表征，判断葡寡糖的连接方式㊂以［Ｍ＋Ｎａ］＋为母离子，进行二级质谱分析，结果如图６所示㊂㊀㊀色谱峰１ ８的二级谱图以［Ｍ＋Ｎａ］＋为母离子，母离子易丢失一分子的水，形成［Ｍ＋Ｎａ－Ｈ２Ｏ］＋碎片；丢失葡萄糖，形成一系列Ｂ型碎片，ｍ／ｚ１６４３（Ｂ１０）㊁１４８１（Ｂ９）㊁１３１９（Ｂ８）㊁１１５７（Ｂ７）㊁９９５（Ｂ６）㊁８３３（Ｂ５）㊁６７１（Ｂ４）㊁５０９（Ｂ３）和３４７（Ｂ２）；丢失葡萄糖残基，形成一系列Ｃ型碎片，ｍ／ｚ１６６１（Ｃ１０）㊁１４９９（Ｃ９）㊁１３３７（Ｃ８）㊁１１７５（Ｃ７）㊁１０１３（Ｃ６）㊁８５１（Ｃ５）㊁６８９（Ｃ４）㊁５２７（Ｃ３）和３６５（Ｃ２）㊂完整的Ｃ型和Ｂ型碎片证明寡糖结构为线性㊂同时，［Ｍ＋Ｎａ］＋发生开环断裂，丢失６０Ｄａ，形成０ ２Ａｉ型碎片，ｍ／ｚ１７６３（０ ２Ａ１１）㊁１６０１（０ ２Ａ１０）㊁１４３９（０ ２Ａ９）㊁１２７７（０ ２Ａ８）㊁１１１５（０ ２Ａ７）㊁９５３（０ ２Ａ６）㊁７９１（０ ２Ａ５）㊁６２９（０ ２Ａ４）㊁４６７（０ ２Ａ３）和３０５（０ ２Ａ２），或者丢失１２０Ｄａ，形成２ ４Ａｉ碎片，ｍ／ｚ１７０３（２ ４Ａ１１）㊁１５４１（２ ４Ａ１０）㊁１３７９（２ ４Ａ９）㊁１２１７（２ ４Ａ８）㊁１０５５（２ ４Ａ７）㊁８９３（２ ４Ａ６）㊁７３１（２ ４Ａ５）㊁５６９（２ ４Ａ４）㊁４０７（２ ４Ａ３）和２４５（２ ４Ａ２）㊂丢失６０和１２０Ｄａ，为１ң４连接的特征碎片㊂根据正离子模式下一级和二级质谱数据可知，本文中提取得到的黄芪多糖主要为１ң４连接线性葡聚糖，该部分酸水解后产生ＤＰ４ １１的葡寡糖㊂图６㊀图５中色谱峰１ ８的二级质谱图Ｆｉｇ．６㊀ＳｐｅｃｔｒａｏｆＭＳ／ＭＳｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｐｅａｋｓ１－８ｉｎＦｉｇ．５㊃０１３１㊃㊀第１２期梁㊀图，等：基于部分酸水解⁃亲水作用色谱⁃质谱的黄芪多糖结构表征图６㊀（续）Ｆｉｇ．６㊀（Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ）㊃１１３１㊃色谱第３２卷３ 结论㊀㊀本文借鉴蛋白质组学 自下而上 法，完成对黄芪多糖的表征㊂结果表明，提取得到的黄芪多糖主要为１ң４连接线性葡聚糖，水解后得到ＤＰ４ １１的葡寡糖㊂该研究对其他中药多糖的表征具有一定的示范作用㊂进一步的工作将包括中药多糖水解产物中微量成分的分离和结构表征，以及中药多糖亲水指纹图谱的绘制，研究结果将有助于中药多糖的质量控制㊂参考文献：［１］㊀ＺｈａｎｇＢ，ＬｉｎＲＣ，ＦｅｎｇＦ．ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｆｆａｉｒｓ（张彬，林瑞超，冯芳．中国药事），２００４，１８（９）：５６６［２］㊀ＤｅｎｇＧＱ，ＳｕＺＮ，ＺｈａｎｇＪＲ，ｅｔａｌ．ＭｅｄｉｃａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（邓桂球，苏振宁，张健润，等．医学信息），２０１４，２７（７）：４８［３］㊀ＺｅｎｇＬＮ，ＹｕａｎＹＨ，ＨｕａｎｇＳＹ，ｅｔａｌ．ＦｕｊｉａｎＦｏｒｅｓｔｒｙ（曾丽娜，袁玉虹，黄淑燕，等．福建林业），２０１４（２）：２５［４］㊀ＸｕｅＭ，ＹａｎｇＪＹ，ＤａｎＳＹ，ｅｔａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｕｎｔａｉｎＡｇｒｉ⁃ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ（薛敏，杨继勇，但仕勇，等．山地农业生物学报），２０１４，３３（２）：１４［５］㊀ＨｕＭＨ，ＭａＦＬ，ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＨｅｒａｌｄ（胡明华，马方励．科技创新导报），２０１０（３０）：１０［６］㊀ＲｅｉｓＡ，ＤｏｍｉｎｇｕｅｓＭＲＭ，Ｆｅｒｒｅｒ⁃ＣｏｒｒｅｉａＡＪ，ｅｔａｌ．Ｃａｒ⁃ｂｏｈｙｄｒＰｏｌｙｍ，２００３，５３（１）：１０１［７］㊀ＤａｎｉｅｌＲ，ＣｈｅｖｏｌｏｔＬ，ＣａｒｒａｓｃａｌＭ，ｅｔａｌ．ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ，２００７，３４２（６）：８２６［８］㊀ＡｋｐｉｎａｒＯ，ＥｒｄｏｇａｎＫ，ＢａｋｉｒＵ，ｅｔａｌ．ＬＷＴ⁃ＦｏｏｄＳｃｉＴｅｃｈ⁃ｎｏｌ，２０１０，４３（１）：１１９［９］㊀ＹａｎＸ，ＥｖｅｎｏｃｈｅｃｋＨＭ．ＣａｒｂｏｈｙｄｒＰｏｌｙｍ，２０１２，８７（２）：１７７４［１０］㊀ＡｋｐｉｎａｒＯ，ＥｒｄｏｇａｎＫ，ＢｏｓｔａｎｃｉＳ．ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ，２００９，３４４（５）：６６０［１１］㊀ＤｕＢＪ，ＳｏｎｇＹ，ＨｕＸＳ，ｅｔａｌ．ＩｎｔＪＦｏｏｄＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ，２０１１，４６（５）：９８２［１２］㊀ＷａｎｇＨＨ，ＤａｉＪ，ＣｈｅｎＳＷ，ｅｔａｌ．ＦｏｏｄａｎｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（王浩豪，戴军，陈尚卫，等．食品与发酵工业），２０１１，３７（１２）：１３３［１３］㊀ＧａｎｇｏｌａＭＰ，ＪａｉｓｗａｌＳ，ＫｈｅｄｉｋａｒＹＰ，ｅｔａｌ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ，２０１４，１５４：１２７［１４］㊀ＡｌｐｅｒｔＡＪ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ，１９９０，４９９：１７７［１５］㊀ＨｅｍｓｔｒｏｍＰ，ＩｒｇｕｍＫ．ＪＳｅｐＳｃｉ，２００６，２９（１２）：１７８４［１６］㊀ＬｉａｎｇＸＭ．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（梁鑫淼．色谱），２０１１，２９（３）：１９１［１７］㊀ＡｉＬＺ，ＷｕＹ，ＧｕｏＢＨ，ｅｔａｌ．ＳｈａｎｄｏｎｇＦｏｏｄＦｅｒｍｅｎｔａ⁃ｔｉｏｎ（艾连中，吴艳，郭本恒，等．山东食品发酵），２００８（１）：３９［１８］㊀ＨｅＹＴ，ＰａｎＸＭ．ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ（何余堂，潘孝明．食品科学），２０１０，３１（１７）：４９３㊃２１３１㊃。
亲水相互作用色谱-串联质谱法同时测定动物组织中金刚烷胺与利巴韦林
亲水相互作用色谱-串联质谱法同时测定动物组织中金刚烷胺与利巴韦林邵琳智;姚仰勋;谢敏玲;林峰【摘要】采用亲水相互作用色谱-串联质谱技术,建立了同时测定动物组织中金刚烷胺和利巴韦林的方法.样品加入同位素内标,采用20 g/L三氯乙酸提取,经磷酸酯酶酶解,PBA固相萃取小柱净化后,采用HILIC色谱柱(100 mm×2.1 mm,3μm)分离,以5 mmoL/L乙酸铵水溶液(含0.19％甲酸)-乙腈为流动相梯度洗脱,采用电喷雾离子源串联质谱,在正离子扫描方式下以多反应监测(MRM)模式检测,内标法定量.在优化条件下,金刚烷胺和利巴韦林在0.5～ 5.0 μg/L质量浓度范围内线性关系良好,定量下限分别为1.0 μg/kg和2.0 μg/kg.在鸡肉和鸡肝样品中,金刚烷胺和利巴韦林在3个加标水平(分别为1.0、2.0、5.0 μg/kg和2.0、5.0、10.0 μg/kg)下的平均回收率为89.2％～109％,相对标准偏差为2.0％～9.3％.该方法准确可靠、方便快捷,适用于动物组织中金刚烷胺和利巴韦林的同时定量分析.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2013(032)012【总页数】5页(P1448-1452)【关键词】亲水相互作用色谱-串联质谱法;金刚烷胺;利巴韦林;动物组织【作者】邵琳智;姚仰勋;谢敏玲;林峰【作者单位】广东出入境检验检疫局,广东广州510623;广东出入境检验检疫局,广东广州510623;广东出入境检验检疫局,广东广州510623;广东出入境检验检疫局,广东广州510623【正文语种】中文【中图分类】O657.63;TQ460.72食品安全问题是近年来最受关注的问题之一，2012年底媒体又曝出了“速生鸡”事件［1］，某些肉鸡养殖企业违反国家兽药管理条例，在养殖过程中喂食金刚烷胺和利巴韦林等人用抗病毒药品，引起了人们极大的关注。
金刚烷胺和利巴韦林均为抗病毒药物，由于其毒副作用强，易引起免疫系统损伤和致畸。
亲水相互作用色谱-高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖
亲水相互作用色谱-高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖吴成玲;刘建芬;张真庆【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2015(43)8【摘要】建立了亲水相互作用-液相色谱-质谱联用分析糖胺聚糖类复杂样品的方法.在高分辨质谱联用条件下,流动相5 mmol/L醋酸铵缓冲溶液可有效使用.在此基础上,对不同的色谱柱进行了筛选.其中,氨基亲水相互作用色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分离效果不佳;酰胺基亲水相互作用色谱柱仅适用于透明质酸寡糖的分析,可以有效分离聚合度2～20的透明质酸寡糖;在较高温度下,两性离子基质的亲水相互作用色谱柱可以对聚合度2～30的透明质酸寡糖和聚合度2～ 12的硫酸软骨素寡糖有效分离;而二醇基亲水相互作用色谱柱对透明质酸(聚合度2 ～30)、硫酸软骨素(聚合度2～20)以及肝素(聚合度4～ 20)都适用,并呈现出较好的分离效果.本研究比较了不同类型的亲水相互作用色谱结合高分辨质谱对不同聚合度、不同电荷密度的糖胺聚糖寡糖的分离特点,建立了相应的高效分离和分析方法.本方法有较高的分辨率和质谱适用性.【总页数】5页(P1198-1202)【作者】吴成玲;刘建芬;张真庆【作者单位】苏州大学药学院,苏州215123;协和制药,石家庄050083;苏州大学药学院,苏州215123【正文语种】中文【相关文献】1.亲水相互作用色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法r测定肝组织中羟脯氨酸[J], 刘伟;戚胜兰;徐莹;肖准;付亚东;陈佳美;杨涛;刘平2.亲水相互作用色谱-四极杆／静电场轨道阱高分辨质谱检测奶粉中的氟乙酸钠 [J], 赵善贞;伊雄海;时逸吟;徐牛生;张凯元;邓晓军3.亲水相互作用色谱柱串联C18柱高效分析饮品中的胭脂红 [J], 刘智敏; 余诗雨; 刘育坚; 许志刚; 刘宏程; 司晓喜4.亲水相互作用色谱高效分析人尿液中的ATP [J], 杨怡;王丹;刘智敏;许志刚5.疏水相互作用与亲水相互作用组合色谱纯化缩宫素 [J], 张晓鸥;宋茂谦;王长海;Jan-Christer Janson;顾铭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
超高效亲水作用色谱-串联质谱法检测水中的苦味酸及苦氨酸
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色
是许多芳香族硝基化合物生产过程中的副产物［２］ 。 苦味酸具有强氧化性和强酸性，在环境中很快降解 成毒性更大的苦氨酸等降解产物［３］ 。 苦味酸是我国地表水常规监测化合物，目前的 国标方法采用衍生化⁃气相色谱法检测水体中的苦 味酸［４］ 。 该方法首先需要将沸点较高（３００ ℃ ） 的苦 味酸衍生成沸点较低（ １１２ ℃ ） 的氯化苦，采用气相 色谱⁃电子捕获检测器（ ＥＣＤ） 进行检测。 该方法存 在 ３ 个比较大的缺陷，一是需要用毒性较大的苯进 行萃取；二是用于反应的次氯酸钠不稳定，衍生反应 难以控制，且氯化苦是一种极易爆炸的物质，具有一 定的 危 险 性； 三 是 采 用 ＥＣＤ 难 以 对 目 标 物 准 确 定性。 由于苦味酸是一种强酸和强极性化合物，其在 ２５ ℃ 时电离常数达 ０������ ４２，在水中能够较为充分的电 离，以至于在普通反相色 谱 柱 中 难 以 实 现 有 效 保 留［５］ 。 为了尽可能地使其在反相色谱柱中保留，需 要在初始流动相中使用很高比例的水相，以降低洗 脱能力，使得方法的灵敏度较低［６］ 。 在以往的文献 报道中对于苦味酸的保留通常有两种方式［７］ ：一种 采取离子抑制的方法，即在流动相中添加酸性缓冲 盐以抑制苦味酸的电离，如 Ｎｉｐｐｅｒ 等［８］ 使用组成为 ３５％ （ ｖ ／ ｖ） 甲醇和 ６５％ （ ｖ ／ ｖ） 醋酸钠（ ｐＨ 为 ４������ ８） 的 流动相分析苦味酸；另一种方法是使用离子对试剂， 通过离子对试剂与待测离子结合增加其疏水性，从 而增加待 测 离 子 在 反 相 色 谱 柱 中 的 保 留， 如 Ｙｏｓｔ 等［９］ 使用组成为 ５０％ （ ｖ ／ ｖ） 乙腈和 ５０％ （ ｖ ／ ｖ） ０������ ０５ ｍｏｌ ／ Ｌ 辛 烷 磺 酰 的 流 动 相， 且 流 动 相 中 含 有 ０������ １ ｍｏｌ ／ Ｌ 的三丁基氢氧化铵（ ｔｒｉｂｕｔｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙ⁃ ｄｒｏｘｉｄｅ， ＴＢＡＨ） 离子对试剂。 通常使用的离子对 试剂 ＴＢＡＨ 并 不 适 合 液 相 色 谱⁃质 谱 （ ＬＣ⁃ＭＳ） 分 析，因为不挥发的离子对试剂会在 ＬＣ⁃ＭＳ 接口处沉 淀而污染离子源。 所以在 Ｐａｍｍｅ 等［７］ 的实验中使 用了三 丁 基 甲 酸 铵 （ ｔｒｉｂｕｔｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｅ， ＴＢＡＦ） 这种挥发性的离子对试剂。 但是，离子对试 剂的使用一方面需要考虑其是否能够完全反应，另 一方面如果离子对在进样口处不能及时完全挥发仍 然可能导致仪器的污染。 以上所述的液相方法及衍 生化 ＬＣ⁃ＭＳ 方 法 中， 由 于 仪 器 灵 敏 度 只 能 达 到 ｍｇ ／ Ｌ 级［７－９］ ，因此必须采取高倍浓缩、净化等方式 进行样品前处理，需要时间较长，过程复杂。 亲水作用色谱主要针对在普通反相色谱中保留 弱或者不保留的极性物质，并且可以缓解在反相液 相色谱中流动相中高水相引起的反压高及质谱信号
亲水相互作用色谱-四极杆／静电场轨道阱高分辨质谱检测奶粉中的氟乙酸钠
亲水相互作用色谱-四极杆／静电场轨道阱高分辨质谱检测奶粉中的氟乙酸钠赵善贞;伊雄海;时逸吟;徐牛生;张凯元;邓晓军【摘要】基于亲水相互作用色谱-四极杆／静电场轨道阱高分辨质谱系统，建立了奶粉中氟乙酸钠的快速筛查和定量检测方法。
奶粉样品用水溶解后经正己烷脱脂，用6 mol／L 硫酸调节 pH 值，经乙腈提取后用亲水相互作用色谱-四极杆／静电场轨道阱高分辨质谱进行分析。
结果表明，该方法在1～50μg／kg 范围内线性关系良好，定量限为1μg／kg，平均回收率为85.5％～106％，相对标准偏差为5.20％～13.6％。
该方法可用于配方奶粉、脱脂奶粉和乳清粉等奶粉产品中氟乙酸钠的快速筛查和定量分析。
%A method for the determination of sodium fluoroacetate in milk powder by hydro-philic interaction chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry was developed. After the sample was dissolved by water,sodium fluoroacetate was degreased by hexane. The pH value of the extractant was adjusted by 6 mol/L H2SO4. After extracted by acetonitrile,the extractant was determined by hydrophilic interaction chromatog-raphy-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry. The linear range of the sodium fluoroacetate was from 1 to 50 μg/kg,with the correlation coefficients greater than 0. 99. By detecting the spiked samples,the limits of quantification were 1 μg/kg, while the recoveries were in the range of 85. 5%-106% with the relative standard deviations ( RSDs)between 5. 20% and 13. 6%. This method can be used for the quickdetermination of sodium fluoroacetate in powder formula,skimmed milk powder and whey powder.【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2016(034)004【总页数】4页(P397-400)【关键词】亲水相互作用色谱;四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱;氟乙酸钠;奶粉【作者】赵善贞;伊雄海;时逸吟;徐牛生;张凯元;邓晓军【作者单位】上海出入境检验检疫局，上海 200135;上海出入境检验检疫局，上海200135;上海出入境检验检疫局，上海200135;赛默飞世尔科技中国有限公司，上海 201206;上海出入境检验检疫局，上海 200135;上海出入境检验检疫局，上海 200135【正文语种】中文【中图分类】O658研究论文氟乙酸钠(C2H2FO2Na)又名“1080”,是一种用于杀灭啮齿类动物的常见鼠药,对人和动物有剧毒作用,受公安部门管制。
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10 0 -10 -20 -30 18 20
22 24 t （ min ）
26
28
30
图1 Fig． 1
酰胺基亲水相互作用色谱柱 30℃ 条件下所得透 Chromatograms of hyaluronic acid （ HA ） obtained on
明质酸分离谱图 amidehydrophilic interaction liquid chromatography（ HILIC） column
2． 2． 2
（ 250 mm×4． 6 mm， 5 μm，日本 COSMOSIL 公司） ； 酰胺基HILIC 色谱柱（ 250 mm×4． 6 mm， 5 μm， 北京 30 min 内流动相 B 从 90% 降到 35% 进行梯度洗脱； 两性 华谱新创公司） ， 柱温 30℃ ， 流速 0． 5 mL / min， HILIC 色 谱 柱 （ 100 mm × 2． 1 mm，5 μm， 离子 （ ZIC ） 德 国 Merck 公 司 ） ， 柱 温 30℃ /85℃ ， 流速 0． 3 mL / min， 25 min 内流动相 B 从 90% 降到 35% 进行梯度洗脱； 二醇基HILIC 色谱柱 （ 150 mm × 3 μm LUNA，加拿大 Phenonenex 公司 ） ， 25 min 内流动相 B 从 2． 0 mm， 柱温 30℃ ， 流速 0． 3 mL / min， 90% 降到 35% 进行梯度洗脱。 寡糖的质谱分 析 氮 气 用 作 雾 化 气， 雾 化 压 力 为 30 Pa。 喷 雾 电 压 为 3． 5 kV， 氮气流速为 8 L / min， 干燥过程中温度为 350℃ 。碎片电压为 100 V。 在 m / z 100 ～ 2000 的范围内进行全离子流扫 2． 2． 3 描。所有数据都在负离子模式下进行采集 ， 经 Mass Hunter 工作站下处理。
第 43 卷 2015 年 8 月
分析化学 （ FENXI HUAXUE）
研究报告
第8 期 1198 ～ 1202
DOI： 10． 11895 / j． issn． 02533820． 150228
Chinese Journal of Analytical Chemistry
亲水相互作用色谱 - 高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖
A 寡聚糖分 聚糖分离谱图（ B） 色谱柱 85℃ 条件下所得 HA 寡聚糖分离谱图（ C） 色谱柱 85℃ 条件下所得 CS离谱图 Fig． 2 HA / chondroitin sulfate A（ CSA） oligosaccharides obtained on the zwitterionic （ ZIC ） HILIC column． （ A ） Chromatogram of HA oligosaccharides obtained on ZICHILIC column at 30℃ ； （ B ） ZICHILIC column at 85℃ ； and （ C） ZICHILIC column at 85℃
2
2． 1
实验部分
仪器与试剂 Agilent 1260 Infinity 液相色谱仪串联四级杆 / 飞行时间（ Q / TOF ） 质谱（ 6540， 美国 Agilent 公司） 。醋 A（ CSA） 和 HA（ 美国 Sigma 公司） ； 乙腈（ 德国 Merck 公司） ； 软骨素 ABC 酶（ Chondroiti酸铵、 硫酸软骨素nase ABC， 北京艾德豪克国际技术有限公司） ； 低分子量肝素： 依诺肝素为美国药典标准品（ USP） 。
dp20 dp24
15.0 t (min)
17.5
20.02Biblioteka .525.025.5
5 -5 -15 -25 -35 2.5
C
dp2 dp4 dp6 dp8 dp10 dp12
A232 (mAU)
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0 t (min)
17.5
20.0
22.5
25.0
25.5
图2
HILIC 色谱柱所得 HA / 硫酸软骨素 A 寡聚糖分离谱图。（ A） 色谱柱 30℃ 条件下所得 HA 寡 两性离子-
2． 2 2． 2． 1
实验方法
CSA 寡糖 分别取 2． 0 mg HA 和 CSA 样品溶于 400 μL 酶解缓冲液 酶水解制备 HA 寡糖、 （ 10 mmol / L 磷酸盐缓冲液， pH 6． 8 ） ， A 样品配制成 5 mg / mL 溶液， 将 HA 和 CS分别加入软骨素酶 ABC 5 mU， 置于水浴箱中 37℃ 反应 4 h。酶解液高温灭活然后离心， 上清液备用。 HILIC） 流动相 A 为 5 mmol / L 醋酸铵溶液， 寡糖的高效液相亲水相互作用色谱分析 （ HPLC95% 乙腈溶液， HILIC 色谱柱 流动相 B 为 5 mmol / L 醋酸铵紫外检测器设置为 232 nm 在线检测。氨基-
3
3． 1
结果与讨论
HILIC 色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分析 氨基15］ HILIC 色谱柱已被用于糖胺聚糖二糖分析［15］， 在文献［ 中， 氨基但该法以高浓度不挥发性缓冲
因此无法与质谱联用， 而且对于寡糖的分离和分析并没有直接的报道 。 本实验使用氨 盐作为流动相， HILIC 色谱柱进行糖胺聚糖的寡糖分析 ， 基结果表明， 即使在高浓度醋酸铵缓冲盐的条件下， 寡聚糖仍 然无法被完全洗脱（ 谱图未显示） ， 而据经验 100 mmol / L 以上的挥发性盐已经对质谱检测造成了影响 。 造成这种现象可能是该氨基柱中树脂表面键合的 氨基基团与糖胺聚糖寡糖结合作用太强， 而挥发
与含有较少负电荷的 HA 的寡聚糖产生适当的相互作用， 并能够有效分离 HA 寡糖。 3． 3 两性离子（ ZIC） HILIC 色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分析 HILIC 色谱柱分别对 3 种糖胺聚糖类寡糖进行了分析。结果表明， HA 寡糖在聚合 本实验使用 ZIC度 2 ～ 28 的范围内达到较好分离， 如图 2A 所示， 其中质谱结果确认了它们的聚合度 （ 图谱未显示 ） 。 ZICHILIC 的两性离子基质使得 HA 寡聚糖达到了更高的分辨率。 然而 HA 的每一个寡糖都分裂成了 16 ， 17 ］ ， 两个峰， 这是由寡糖还原端产生的 α和 β构型共存导致的 （ 图 2A ） 。根据文献［ 增加柱温可以 减少或消除这种现象。因此， 本实验中将柱温升高到 85 "C ， 每个 HA 寡糖在常温下出现的双峰完全消
质素（ KS） 。糖胺聚糖类与蛋白质相互作用的特异性取决于糖胺聚糖种类 、 大小、 糖组成、 电荷密度和序 ［4 ， 5 ］ 2! 。相对于糖胺聚糖的其它结构特征 ， SO4 的数量 （ 电荷密度 ） 对于调节生物学功能来说具有更 列等
［9 ］ ! 。糖胺聚糖所含 SO2 。糖胺聚糖类寡糖经常 4 数目多少大体排序为 HP＞DS ≈ CS ≈ HS＞HA 被作为模型， 用于研究糖胺聚糖结构与活性的关系 。针对不同糖胺聚糖构效关系研究、 糖胺聚糖酶活力
0531 接受 20150321 收稿； 2015本文系国家自然科学基金（ No． 81473179 ） 资助 * Email： liujianfen888@ 163． com； z_zhang@ suda． edu． cn
第8 期
吴成玲等： 亲水相互作用色谱高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖
1199
3． 4
吴成玲
1
1
刘建芬
* 2
2
张真庆
* 1
（ 苏州大学药学院，苏州 215123 ）
（ 协和制药， 石家庄 050083 ）
摘
要
建立了亲水相互作用 液相色谱质谱联用分析糖胺聚糖类复杂样品的方法 。 在高分辨质谱联用条
件下， 流动相 5 mmol / L 醋酸铵缓冲溶液可有效使用 。在此基础上， 对不同的色谱柱进行了筛选 。 其中， 氨基 亲水相互作用色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分离效果不佳； 酰胺基亲水相互作用色谱柱仅适用于透明质酸寡 糖的分析， 可以有效分离聚合度 2 ～ 20 的透明质酸寡糖； 在较高温度下， 两性离子基质的亲水相互作用色谱柱 可以对聚合度 2 ～ 30 的透明质酸寡糖和聚合度 2 ～ 12 的硫酸软骨素寡糖有效分离； 而二醇基亲水相互作用色 谱柱对透明质酸（ 聚合度 2 ～ 30 ） 、 硫酸软骨素（ 聚合度 2 ～ 20 ） 以及肝素（ 聚合度 4 ～ 20 ） 都适用， 并呈现出较 好的分离效果。本研究比较了不同类型的亲水相互作用色谱结合高分辨质谱对不同聚合度 、 不同电荷密度的 糖胺聚糖寡糖的分离特点， 建立了相应的高效分离和分析方法 。本方法有较高的分辨率和质谱适用性 。 关键词 亲水相互作用色谱； 四极杆 / 时间飞行质谱； 糖胺聚糖； 寡糖
A232 （ mAU ）
30 20
dp2 dp4 dp6 dp8 dp10 dp12 dp14 dp18 dp20 dp16
性盐的离子强度太弱， 无法对寡糖进行洗脱， 因此 HPLCMS 。 不能进行 分析 3． 2 分离 HILIC 色 谱 柱 分 别 对 HA、 CSA 采用 酰 胺 基HA 寡聚糖能够得到很 和 HP 进行分析， 结果表明， 好的分离， 如图 1 所示。 根据相应质谱结果 （ 图谱 未显示） ， 色谱图中每个峰得到了准确的归属。 其 中 HA 寡聚糖在聚合度 2 ～ 20 的范围内能够得到 A 与 HP 很好的分离。然而在使用此色谱柱对 CS寡糖混合物进行分离时， 在合理的缓冲盐浓度范 围内无法有效洗脱寡糖 （ 谱图未显示 ） 。该色谱柱 能够 树脂表面的酰胺基团具有较弱的离子作用， HILIC 色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的 酰胺基-
IPＲP 方法有较好的分辨率， 而且所使用的挥发性离子对试剂可以用于质谱， 但是它们通常残留在离子 源和毛细管中， 从而降低了质谱的灵敏度和分辨率