补体活性检测、补体参与的溶血试验

补体活性检测、补体参与的溶血试验

理解：

1.补体的概念和性质

2.补体的三条活化途径基本原理

掌握：

1.血清补体总活性测定的实验原理、实验方法

2.补体结合实验的实验原理、实验方法

3.各种补体检测方法的临床应用

一、补体性质与活化途径

（一）二、补体的概念

补体（Complement，C）：是一组存在于血液和组织液中，具有级联酶促反应特征、不耐热的糖蛋白，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充成分

（二）补体系统的组成

补体固有成分：如C1(q、r、s)、C2、C3……C9

补体调节蛋白：如B因子、D因子、P因子、H因子

补体受体：C3R，CR1，CR2等

（三）补体的激活途径

经典激活途径、旁路活化途径

（四）补体的生物学功能

1.细胞毒溶菌作用

2.调理作用：C3b、iC3b、C4b

3.炎症介质作用：C3a、C5a、C567

生物学检测：总补体活性检测、单个补体活性检测

免疫学检测：单个补体成分检测、补体受体成分检测

二、血清补体总活性测定

1.补体总活性测定原理

反应系统的组成：抗原+Antibody->活化补体

↓↓↓

绵羊红细胞+溶血素+待检测补体

↓

溶血反应

(1)溶血反应：

通过经典途径或旁路途径激活的补体，作用于致敏红细胞，使红细胞表面形成若干孔，水分等进入红细胞，引起红细胞的肿胀破裂而溶血

(2)CH50检测原理

在溶血反应中，补体溶血程度与补体的活性相关，但非直线关系

以溶血百分率为纵坐标，相应补体含量为横坐标，溶血程度对补体含量依赖呈特殊的S型曲线

以50％溶血作为终点指标，比100％溶血更为敏感，这一方法称为补体50％溶血试验（CH50）

(3)CH50（50% complement hemolysis）：

补体总活性测定方法，以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，故称补体50％溶血试验（CH50）

2.实验材料

(1)绵羊红细胞

①使用等量或两倍的阿氏保存液混合，便于抗凝和储存

②临用前生理盐水洗涤红细胞

③使用浓度一般为2~5％

(2)配制50％溶血标准管

①2％SRBC悬液0.5ml+2.0ml蒸馏水使其溶解

②加入2.0ml1.8％NaCl溶液校正为等渗溶液

③加入2％SRBC溶液0.5ml，即为50％溶血状态

(3)溶血素（抗SRBC Ab）

①用SRBC免疫家兔得到兔抗SRBC血清

②试验前应预先加热（56℃，30min），灭活补体

③滴定溶血素的效价：产生完全溶血的最高稀释度为溶血素的效价

(4)缓冲液

①磷酸盐缓冲液或巴比妥缓冲液

②pH应调至7.2-7.4之间

③适量氯化钠保持等渗

④并适量加入一些Ca2+和Mg2+

(5)补体

①作为待检对象：标本必须新鲜

②作为主要试剂（单个补体检测）：多采用豚鼠血清，必须新鲜

-70℃可保存数月，避免反复冻融

存在个体差异, 三只以上血清混合使用

3.CH50检测方法

判定标准与计算

标准：选择溶血程度与50％溶血的标准管相近的两管，以溶血程度最接近标准管的那一管定为终点管

计算：CH50(U/ml）＝(1/血清用量）×稀释倍数

参考范围：50-100 U/ml

4.临床意义

CH50主要检测的是经典途径的补体溶血活性，所反映的主要是补体9种成分的综合水平

测定值过低或完全无活性，首先考虑补体缺陷，可分别检测血清中C4、C2、C3、C5等单个成份的含量

三、单个补体成分的测定

1.单个补体成分的检测对象主要包括：C3、C4、 C1q、B因子等

2.测定方法：溶血法（检测单个补体的溶血活性）

免疫化学法（测定补体含量）

3.试验方法

致敏SRBC+反应系统补体（缺待检成分）→不溶血

致敏SRBC+反应系统补体（缺待检成分）+待检血清→溶血

4.溶血法

(1)原理：抗原与其特异性抗体（IgG、IgM型）结合后，可激活补体导致细胞溶解

(2)组成：①试剂指示系统（致敏SRBC）

②试剂补体系统（待检补体缺失）

③待检血清（是否含待检补体？）

(3)试剂补体系统

选用先天或人为导致的缺乏某单一补体成分的动物或人血清作为试剂，如人缺C2血清、豚鼠缺C4血清、小鼠缺C5血清、兔缺C6血清等

(4)应用与评价

①诊断补体某单个成分缺失或其含量正常但无溶血活性的先天性补体缺陷

②定性方法，检测单个补体成分

③无需特殊仪器，快速，但灵敏度低，影响因素多

四、补体结合试验（complement fixation test，CFT）

1.反应系统的组成：抗原+Antibody->活化补体→溶血反应

2.概念

补体结合试验（complement fixation test，CFT）：将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应系统中抗原或抗体的传统方法

3.原理

(1)三个系统（包括5个成分）：

①反应系统：已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）

②补体系统：C1-9及其缓冲液

③指示系统：SRBC与相应溶血素（SRBC抗体）常预先混合形成致敏红细胞

(2)补体作用无特异性，既可与反应体系中的抗原抗体复合物结合，也能与SRBCs结合

(3)两个阶段：

第一步：反应系统与补体系统作用

第二步：指示系统（SRBCs）与剩余补体反应

4.试验方法

结果判定：

(1)补体对照管 2U全溶，1U为全溶或略带少许RBC，0.5U应不溶

(2)若0.5U补体对照管出现明显溶血，表示补体用量过多；如2U不出现溶血，表示补体用量不够

(3)受检血清不溶血为阳性，溶血为阴性

5.试验试剂

(1)抗原和抗体的效价

方法：方阵法进行滴定

选择抗原与抗体二者都呈强阳性反应的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（1单位）