黏液型铜绿假单胞菌的毒力基因、产金属酶检测与耐药性研究

黏液型铜绿假单胞菌的毒力基因、产金属酶检测与耐药性研究谢国艳;高志生;李星军;钱敏健;李小兰
【摘要】Objective To comparison in virulence genes,metallo-β-lactanase-producing(MBLs)and drug-resistance between mucoid and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa(PAE),and provide reference for the clinical use of antimicro-bial agents.Methods All strains were identified by ATB
strip,drug-resistance by K-B method,virulence genes exoS、exoU and exoY by PCR,and MBLs by modified Hodge Test(MHT).Results Of 13 kinds of antimicrobial agents,Non-mucoid PAE were higher resistance than mucoid PAE,and were significantly higher than mucoid PAE in gentamicin, aztreonam,levofloxacin,imipenem and meropenem.The detection rates of MBLs,exoU+/exoS-/exoY-and exoU-/ex-oS-/exoY-of 6 kinds genotyopes in non-mucoid PAE were significantly higher than mucoid PAE.The detection rates of 3 kinds of virulence genes in mucoid PAE were higher than non-mucoid PAE,but they were not significant.Conclusion For avoiding non-mucoid turn into mucoid,we must select the sensitive antibiotic early and quikly to remedy PAE in-fection.%目的比较两种表型铜绿假单胞菌(PAE)毒力
基因、产金属酶(MBLs)及耐药性,为临床治疗和医院感染控制提供依据.方法采用ATB鉴定系统进行菌株鉴定,筛选出两种表型菌株;纸片扩散法检测耐药性;PCR方
法检测毒力基因exoS、exoU和exoY;改良Hodge试验(PAE-MHT)法检测MBLs.结果非黏液型PAE对各种抗生素的耐药率均高于黏液型,其中对庆大霉素、氨曲南、左氧氟沙星、亚胺培南、美罗培南的耐药率明显高于黏液型;同时非黏液型MBLs
阳性率明显高于黏液型;3种毒力基因阳性率黏液型均高于非黏液型,但两者比较无
显著性差异;6种基因型中,除exoU+/exoS-/exoY-和exoU-/exoS-/exoY-两种基因型非黏液型明显高于黏液型外,其余四种基因型的比较无显著性差异.结论针对PAE感染,应尽早尽快选择敏感药物治疗,以免非黏液型转化成黏液型后,增加治疗难度.
【期刊名称】《中国实验诊断学》
【年(卷),期】2018(022)001
【总页数】4页(P121-124)
【关键词】毒力;铜绿假单胞菌;黏液型;毒力基因;金属β-内酰胺酶
【作者】谢国艳;高志生;李星军;钱敏健;李小兰
【作者单位】上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院检验科,上海 202150;上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院检验科,上海 202150;上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院检验科,上海 202150;上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院检验科,上海 202150;重庆市两江新区第一人民医院检验科,重庆401121【正文语种】中文
【中图分类】R446.5
铜绿假单胞菌(PAE)是医院感染的主要致病菌之一，根据其菌落形态及是否产生藻酸盐形成生物膜分为黏液型和非黏液型。

近年来黏液型PAE不断增多，其易黏附在组织黏膜上并且不易被吞噬，使其逃避机体免疫清除和增强了对抗菌药物的耐药性[1]，常出现体外药敏结果与临床治疗不一致的现象，而产金属β-内酰胺酶(MBLs)且携带毒力基因的黏液型PAE菌株的不断增多，更给临床治疗带来更大的
难题。

PAE致病机制与Ⅲ型分泌系统(T3SS)密切相关[2]，T3SS主要分泌ExoS、ExoT、ExoY、ExoU 4种毒素，exoU和exoY具有快速而独特的细胞毒作用，危害最大，exoS和exoT基因感染相对较轻，而ExoT是所有菌株都会产生的，因
此本研究拟分析两种表型PAE的毒力基因exoS、exoU、exoY的携带情况、MBLs的流行及耐药情况，为本地区临床诊断治疗提供帮助。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源收集自我院2014年6月至2016年11月临床非重复分离的200
株PAE(筛选出82株黏液型和118株非黏液型菌株)，菌株经ATB细菌鉴定仪进
行菌种鉴定，以甘油肉汤-20℃保存备用。

铜绿假单胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC70063购自上海市临检中心。

1.1.2 仪器及试剂 ATB细菌鉴定仪与ID 32 GN鉴定板(法国梅里埃)、7000型荧
光定量PCR扩增仪(美国Applied Biosystems)、凝胶成像系统(美国BIO-RAD)、MH琼脂平皿(上海科玛嘉)、药敏纸片(英国OXOID)；引物和探针及测序由上海生工公司完成。

1.2 方法
1.2.1 细菌鉴定及药敏试验采用ATB细菌鉴定仪进行菌种鉴定。

表型分型则选取
生长缓慢(35℃培养48 h后血平板可见湿润、透明似小水滴样、黏稠，麦康凯平
板上形成无色半透明、嵌入培养基中不易挑起的黏液状菌落)，进一步氧化酶阳性、挑丝试验阳性者判定为黏液型PAE[3]。

采用纸片扩散法进行药敏试验[4]，铜绿假单胞菌ATCC27853作为质控菌株。

1.2.2 MBLs检测改良Hodge试验(PAE-MHT)法[5]。

1.2.3 毒力基因的检测根据参考文献[6,7]设计引物(由上海博亚公司合成)。

细菌DNA的制备采用煮沸裂解法，取上清液2 μl用于PCR扩增。

PCR反应体积为50
μl，包括25 mmol/LMgCl24 μl，10×PCR缓冲液5 μl，上、下游引物各0.5 μl，dNTP 1 μl，Taq酶3 μl，模板2 μl，无菌蒸馏水34 μl，石蜡油覆盖。

扩增条件：94℃5 min；续以94℃30s；exoS、exoY和exoU退火温度分别为55℃、55℃
和59℃，30 s；72℃1 min,35个循环；72℃延伸5 min。

取5 μl PCR产物采用20 g/L琼脂糖凝胶进行电泳分析。

未加模板的无菌蒸馏水作为阴性对照。

毒力基
因引物序列和目的产物长度见表1。

PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察分析结果。

选取扩增阳性产物纯化后测序，结果与GeneBank中已
知序列对比分析。

表1 引物序列表目的基因引物序列产物大小(bp)参考文献exoSP15’-CCGGCATTCACTACGCGG-3’573[6]P25’-GTTCGTGACGTCTTTCTTTTA-
3’exoUP15’-GGGAATACTTTCCGGGAAGTT-3’428[6]P25’-CGATCTCGCTGCTAATGTGTT-3’exoYP15’-CGGATTCTATGGCAGGGAGG-3’289[7]P25’-GCCCTTGATGCACTCGACCA-3’
1.2.4 统计学分析用SPSS 13.0软件进行。

组间比较采用χ2检验，以P<0.05为
有统计学意义。

2 结果
2.1 两种表型的菌落对15种抗生素的耐药情况见表2。

表2 不同表型对13种抗生素的耐药情况(%)抗菌药物黏液型(n=82)非黏液型
(n=118)P值阿米卡星16.218.3>0.05庆大霉素10.526.3<0.05哌拉西林
35.246.1>0.05头孢他啶21.629.8>0.05头孢哌酮21.526.7>0.05氨曲南
41.167.6<0.05亚胺培南4.814.4<0.05左氧氟沙星22.648.4<0.05美罗培南
2.411.6<0.05哌拉西林/三唑巴坦8.311.6>0.05头孢哌酮/舒巴坦7.510.6>0.05
头孢吡肟11.314.6>0.05妥布霉素02.6>0.05
2.2 MBLs检测 PAE-MHT法检测200株PAE，其中82株黏液型阳性率为
3.7%(3/82)，118株非黏液型阳性率为13.6%(16/118)，非黏液型MBLs阳性率
明显高于黏液型(P<0.05)。

2.3 毒力基因检测 PCR扩增82株黏液型的exoS、exoU、exoY，阳性率分别31.6%，12.7%，72.3%；118株非黏液型的exoS、exoU、exoY，阳性率分别2
3.3%，8.2%，65.1%。

黏液型与非黏液型3种毒力基因阳性率均无显著性差异(P>0.05)。

几个毒力基因电泳图谱见图1。

2.4 基因型的分布共存在6种基因型，两种表型菌株的基因型比较见表3。

3 讨论
T3SS是PAE致病性的重要毒力系统，其中exoS和exoU的临床意义尤为重要，Hauser等[8]研究显示，exoU+为细胞毒型基因，表达蛋白exoU引起细胞坏死、凋亡，危害最大；exoS+为侵袭型基因，是PAE在感染过程中实现增殖和传播的
主要毒力因子，表达蛋白exoS能抑制宿主细胞吞噬作用、破坏肌动蛋白细胞骨架重排、导致细胞凋亡和抑制细胞分裂等，感染相对较轻；exoU+基因型的PAE毒力更强，感染后症状更严重，患者病死率更高。

本研究共检测3种毒力基因，获
得6种基因型。

3种毒力基因阳性率黏液型均高于非黏液型，但两者比较无显著性差异；比较两种表型的6种基因型，除exoU+/exoS-/exoY-和exoU-/exoS-
/exoY-两种基因型非黏液型明显高于黏液型外，其余四种基因型的比较无显著性
差异。

未发现三种基因同时存在或exoU、exoS这两种基因同时存在的菌株，与exoS和exoU具有排它性、不同时存在于同一菌株的结论[9]相吻合。

注：M为DNA Marker(DL 1000)；3为阴性对照；5为阴性株；1，4为exoY基因阳性分离株；2，7，8为exoU基因阳性分离株；6为exoS基因阳性分离株。

表3 两种表型菌株的基因型比较(%)基因型黏液型(n=82)非黏液型(n=118)P值exoU+/exoS-/exoY+19.226.3>0.05exoU+/exoS-/exoY-16.537.3<0.05exoU-
/exoS+/exoY+35.246.1>0.05exoU-/exoS+/exoY-17.623.8>0.05exoU-/exoS-/exoY+21.526.7>0.05exoU-/exoS-/exoY-41.168.6<0.05
黏液型PAE是其在自然界中存在的一种特殊形式，非黏液型在一定的条件下可转
化成黏液型，其表面存在大量以多糖藻酸盐为主要成分的黏液，从而可形成生物膜[10]。

由于黏液型PAE生长缓慢，菌落黏稠，往往全自动仪器检测药敏失败，因
此本研究采用K-B法对两种表型的PAE进行药敏检测。

从表2看出，两种表型的PAE对妥布霉素、亚胺培南、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟的耐药率较低(<20%)；其次为阿米卡星、庆大霉素、头孢他啶、头孢哌酮、左旋氧氟沙星(>20%)；而对氨曲南、哌拉西林的耐药率较高(>40%)。

对两种表型的PAE耐药性进行比较，发现非黏液型对各种抗生素的耐药率均高于黏液型，其中庆大霉素、氨曲南和左氧氟沙星前者明显高于后者，同时非黏液型对碳青霉烯类的耐药率也明显高于黏液型，这与非黏液型MBLs阳性率明显高于黏液型相一致，也证实了产MBLs是PAE对碳青霉烯类抗菌药物产生耐药性的重要机制[5]。

笔者还发现，临床反馈PAE根据药敏谱选择敏感抗生素后，非黏液型疗效较好，
而黏液型疗效不佳。

在对产黏液型的同一病人5天后再次进行耐药监测，发现此
表型的菌株药敏谱变化不大，说明在短期内无新的耐药机制产生，推测黏液型PAE体外实验敏感而体内用药无效的原因是因为生物被膜的形成阻挡抗生素对细
菌起作用[11]。

由于生物膜的特殊性，黏液型菌株比非黏液型定植更持久，感染更不易清除[12]。

因此针对PAE感染，应尽早尽快选择敏感药物治疗，以免非黏液
型转化成黏液型后，增加治疗难度。

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