丹参脂溶性及水溶性成分集成提取工艺研究

丹参脂溶性及水溶性成分集成提取工艺研究（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：任志会,苏会霞,柏艳柳【摘要】目的优选丹参脂溶性及水溶性成分的集成提取工艺条件。

方法采用正交设计法,以丹酚酸B、丹参酮ⅡA为测定指标,采用高效液相色谱法测定其含量,并以此为指标优选集成提取工艺条件。

结果集成法可同时对丹参中脂溶性及水溶性成分进行提取。

优选的提取工艺条件为：加8倍量70%乙醇,提取2次,每次1 h。

结论采用集成方法同时提取丹参水溶性及脂溶性部位,可省时、省工、节能,使丹参的提取工艺合理可行。

【关键词】丹参；提取工艺；正交试验；丹酚酸B；丹参酮ⅡAAbstract：Objective To optimize an integration technique for extracting the liposoluble and water-soluble components of Salvia miltiorrhiza. Methods Salvianolic acid B and Tanshinone ⅡA were selected as marker components and determined by HPLC to optimize the integration extract processof Salvia miltiorrhiza by orthogonal test. Results The liposoluble and water-soluble active components of Salvia miltiorrhiza were efficiently extracted by the optimum integration technique. The integration technique for extracting was obtained：Salvia miltiorrhiza was added with 8 times alcohol of 70% and extracted 1 hour for 2 times. Conclusion The liposoluble and water-soluble active components of Salvia miltiorrhiza can be extracted simultaneously by the novel extraction process which was reasonable and feasible. This new technique can be employed to reduce time, working and energy, and be suitable for the morden production.Key words：Salvia miltiorrhiza；integration technique for extracting；orthogonal test；Salvianolic acid B；Tanshinone ⅡA丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎,主要含有二萜醌类脂溶性及酚酸类水溶性成分。

2005年版《中华人民共和国药典》(一部)以丹参酮ⅡA和丹酚酸B为指标[1],对丹参药材进行质量控制。

为了能同时兼顾丹参脂溶性及水溶性两类有效成分,我们采用正交试验法,以丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量为考察指标,对丹参的提取工艺进行全面优选,以使丹参的提取工艺更科学、合理。

1 仪器与试药Agilent 1100高效液相色谱仪。

丹参酮ⅡA(批号110766- 200518)、丹酚酸B(批号111562-200605)标准品购自中国药品生物制品检定所；丹参药材购自安国药材市场(经河北省药品检验所中药室孙宝惠主任药师鉴定为正品)。

甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果2.1 丹参提取液中丹参酮ⅡA的含量测定方法采用Phenomenex Luna C18色谱柱(5 μm,250 mm×4.6 mm,广州菲罗门科学仪器有限公司),流动相：甲醇-水(75∶25),流速：1.0 mL/min,检测波长：270 nm。

精密称取丹参酮ⅡA对照品10.21 mg,置50 mL棕色量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀；精密量取2 mL,置25 mL 棕色量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,作为对照品溶液(每1 mL中含丹参酮ⅡA 16.32 μg)。

分别取溶剂考察、粒度考察、正交试验及验证试验中回流提取液的稀释液,以0.45 μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,测定回流液中丹参酮ⅡA的含量。

2.2 丹参提取液中丹酚酸B的含量测定方法采用Phenomenex Luna C18色谱柱(5 μm,250 mm×4.6 mm)；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)；流速：1.0 mL/min；检测波长：286 nm。

精密称取丹酚酸B 8.20 mg至10 mL棕色容量瓶中,加75%甲醇至刻度,摇匀,再精密吸取2 mL至10 mL容量瓶中,以75%甲醇定容至刻度,摇匀,得164.0 μg/mL的丹酚酸B标准品溶液。

分别吸取溶剂考察、粒度考察、正交试验及验证试验中回流提取液的稀释液10 mL至25 mL的棕色容量瓶中,以相应溶剂稀释至刻度,摇匀,以0.45 μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μL,注入液相色谱仪,测定回流液中丹酚酸B的含量。

2.3 提取溶剂的选择丹参脂溶性成分易溶于高浓度乙醇,但在预试验中,丹酚酸B在醇提时亦有相当部分被提取出来,所以考虑采用脂溶性部位与水溶性部位进行集成提取,以丹参酮ⅡA、丹酚酸B为含量测定指标,考察乙醇浓度对丹参脂溶性成分及水溶性成分提取率的影响。

称取丹参药材8份,每份30.0 g,平行2组,分别以8倍量水及10%、30%、50%、60%、70%、90%及95%乙醇回流提取2次,每次1.5 h,药液过滤,合并,放置室温,定容至 1 000 mL。

将以上药液取适量,按照上述含量测定方法测定丹参药材及各提取方法样品中丹参酮ⅡA及丹酚酸B的含量,并计算提取率。

结果见表1。

表1 丹参集成提取工艺溶剂的选择（略）表1显示,90%乙醇提取时丹参酮ⅡA的提取率最高,为81.6%,但丹酚酸B提取率仅为48.3%；50%乙醇提取时,丹酚酸B提取率最高为75.1%,但丹参酮ⅡA的提取率仅为40.1%；70%乙醇提取时丹参酮ⅡA的提取率为80.7%,丹酚酸B提取率为73.2%。

为兼顾二者,我们初步选择70%乙醇进行提取。

为验证高浓度乙醇提取后药渣中丹酚酸B的含量,取70%、90%、95%乙醇提取后的药渣再加8倍量的水回流提取2次,每次1 h,药液过滤,合并,放置室温,定容至 1 000 mL。

样品液处理后以HPLC 法进行测定。

结果表明：70%、90%及95%乙醇提取再水提的丹酚酸B 的提取率分别为2.7%、18.4%及36.4%,均较低。

由此可看出,醇提后再水提的工艺条件不合理,其原因可能是丹酚酸B长时间受热,导致分解,使提取率降低,因此,确定采用70%乙醇进行集成提取的工艺条件可行。

2.4 药材粉碎粒度的考察称取丹参药材饮片、最粗粉及粗粉各30.0 g,平行2组,分别以8倍量70%乙醇回流提取2次,每次1.5 h,药液过滤,合并,放置室温,定容至1 000 mL,摇匀,取适量以0.45 μm微孔滤膜过滤,以HPLC法测定丹参酮ⅡA、丹酚酸B的提取率。

结果见表2。

表2 丹参醇提工艺药材粉碎的粒度选择（略）表2显示,饮片及粗粉提取时丹参酮ⅡA的提取率均较最粗粉高,但饮片及粗粉提取时丹参酮ⅡA的提取率在同一水平；饮片、最粗粉及粗粉提取时丹酚酸B提取率分别为77.2%、80.5%、78.3%,三者在同一水平。

从工业生产成本角度考虑,选择饮片直接提取即可。

2.5 正交试验2.5.1 正交试验设计选择乙醇用量、提取时间和提取次数3个因素,进行L9(34)正交设计；并以丹参酮ⅡA、丹酚酸B的提取率为指标,优选丹参合提工艺条件。

因素水平见表3。

2.5.2 正交试验与结果分析平行称取丹参药材9份,每份30 g,按L9(34)正交表试验条件,用70%乙醇进行加热回流提取、滤过,滤液合并至1 000 mL容量瓶中,加70%乙醇定容至刻度,摇匀,测定。

结果及分析见表4～表6。

表3 丹参集成提取因素水平表（略）表 4 L9(34)丹参醇提工艺正交试验结果（略）表5 丹参集成提取正交试验丹参酮ⅡA方差分析表（略）注：F0.05(2,2)=19.00,*P＜0.05 表6 丹参集成提取正交试验丹酚酸B 方差分析表(略)注：F 0.01(2,2)=99,F 0.05(2,2)=19,*P＜0.05,**P ＜0.01方差和直观分析结果表明：因素C对丹参酮ⅡA及丹酚酸B 的提取有显著影响,取3水平；其次为A因素,取3水平；B因素影响最小,可取1水平；最佳提取条件应为A3B1C3,但A和C因素的2水平与3水平相差不大,结合生产,拟取2水平,故拟确定提取条件为A2B1C2,即加8倍量70%乙醇,提取2次,每次1 h。

2.6 验证试验按照正交试验优选醇提工艺条件进行验证试验,结果见表7；结合工业生产,选择优选工艺为丹参提取工艺,与正交试验各工艺结果比较含量较高,表明丹参脂溶性成分及水溶性成分基本提取完全,该醇提工艺条件可行。

表7 丹参醇提工艺验证结果(略)3 讨论以醇提法从丹参中提取的水溶性成分主要是丹酚酸B,以水提法则包含丹酚酸B、丹参素及原儿茶醛等水溶性成分。

药理研究表明,两种提取方法所得部位的药理作用差异无统计学意义,且以醇提法所得的结果较好,并且随丹酚酸B含量提高而活性提高。

鉴于此,我们选择丹酚酸B为水溶性成分的考察指标。

丹参水溶性成分中,主成分丹酚酸B对热不稳定,这在提取溶剂的选择中可看出。

因此,我们先采用高浓度醇提再用水提,丹酚酸B提取率较低,可能为丹酚酸B长时间受热分解所致。

为全面反映丹参有效成分,我们采用先醇提再水提的传统工艺与集成提取工艺相比较,得出集成提取的优选工艺。

本研究结果表明,集成提取能同时兼顾丹参脂溶性和水溶性成分,使丹参的提取工艺更为合理。

【参考文献】[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.52.。