葡萄糖异构酶基因的筛选、表达及酶学性质研究

合集下载

相关主题

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

ａｆｉｎｆｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．ＴｈｅＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｐｕｒｉｉｅｆｄＴＰＧＩｒｅｖｅａｌｅｄａｓｉｎｇｌｅｂａｎｄｗｉｔｈ
ａｓａｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｎｚｙｍｅｗａｓｐｕｒｉｉｆｅｄｂｙＮｉ — ＮＴＡ
ｌｉａｏｅｈｅｎｇｊｕｎ＠ｈｕａｋａｎｇｐｈａｒｍａ．ｅｏｍ．
发酵科技通讯
外，其他各种实验试剂均为国产分析纯。
１．１．３引物
第４Ｊ４卷
引言
葡萄糖异构酶（ｇｌｕｃｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＥＣ５．３．１．５）又称木糖异构酶（ｘｙｌｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ），在体内催化
２０１５年１１月
发酵科技通讯
第４４卷第４期
葡萄糖异构酶基因的筛选、表达及酶学性质研究
廖承军 ’ ，郑微，黄建峰。刘成龙，柳志强，程新平 ’ 。毛宝军 ’ ，陈德水 ’
（１．浙江华康药业有限公司，浙江衢州３２４３０２；２．浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州３１００１４）
萄糖异构酶，已成为实现一步法生产５５％ＨＦＣＳ
１．２．１基因挖掘方法筛选葡萄糖异构酶以最嗜热的Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍｅ来源和催化
活力较高的商业化的Βιβλιοθήκη BaiduＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｕｒｉｎｕｓ来源
目前，工业化生产的ＨＦＣＳ均为４２％ＨＦＣＳ，而５５％ＨＦＣＳ因其口感和甜度等性能拥有最大
Ｉ），以上引物均由上海生工生物工程公司合成。
１．１．４培养基
ＬＢ培养基（ｇ／Ｌ）：蛋Ａ胨１０，酵母粉５，ＮａＣ１１０，ｐＨ７．０，接种之前加入５０￣ｇ／ｍＬ卡那霉素；固体ＬＢ培养基添加１．５％～２．０％琼脂，用于大肠杆菌培养。卡那霉素抗生素贮存液的配制：用无菌水配制５０ｍｇ／ｍＬ的抗生素母液，过滤除菌后，一２０ｏ【＝保存备用，使用时终浓度为５０ｐ￣ｇ／ｍＬ。
ＣＨＥＮＧＸｉｎｐｉｎｇ，ＭＡＯＢａｏｊｕｎ，ＣＨＥＮＤｅｓｈｕｉ
（１．Ｚｈ￣ｉａｎｇＨｕａｋａｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｑｕｚｈｏｕ３２４３０２，Ｃｈｉｎａ；
ＰＡＧＥ检测．结果显示为单一条带，其分子量大小为５０．８ｋＤａ。测定了该重组酶对底物Ｄ一葡萄糖的活力为１９．８Ｕ／ｍｇ，并对其酶学性质进行了表征。该酶最适温度和ｐＨ分别为８５ｃＩ二和７．０，Ｃｏ２＋对催化活力起着非常重要的作用，对底物Ｄ一葡萄糖的值和一值分别为３７３ｍｍｏｌ／Ｌ
１．２方法
的市场需求］。要得到５５％ＨＦＣＳ，需要经历下游
色谱纯化和浓缩等步骤【６ｌ。研究报道显示，葡萄糖
和果糖之问的异构化反应存在着热动力学平衡，随着反应温度的升高，转化率也逐渐升高，当温度大于等于８５℃时，理论转化率可以达到５５％以上ｌ７。因此，筛选构建一株高活力且耐高温的葡
摘要：通过基因挖掘的方法从ＮＣＢＩ数据库中筛选得到一株嗜热的葡萄糖异构酶（ＧＩ）产生
茵株ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｐｅｔｒｏｐｈｉｌａＲＫＵ一１，化学合成该酶的基因并在大肠杆菌ＥｃｏｌｉＢＬ２ｌ（ＤＥ３）中进行可溶性表达。重组葡萄糖异构酶经过Ｎｉ — ＮＴＡ柱亲和层析分离纯化后，对纯酶进行ＳＤＳ —
ｅｑｕｉｌｉｂｉｕｍｒａｆｔｅｒ４ｈｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｇｅｎｏｍｅｍｉｎｉｎｇ；ｇｌｕｃｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
Ｇｅｎｏｍｅｍｉｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａ
ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｇｌｕｃｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅｆｒｏｍ
收稿日期：２０１５ — ０５ — ２８
基金项目：国家自然科学基金（３１４０１５２７）；浙江省重大科技攻关项目（２０１３Ｃ０２０２７）
作者简介：廖承军（１９７６一），男，浙江开化人，工程师，主要从事功能性糖和糖醇生产工艺技术开发和应用，Ｅ－ｍａｉｌ
ａｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆａｒｏｕｎｄ５０．８ｋＤａ．ＴｈｅｓｐｅｃｉｉｆｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＴＰＧＩｔｏＤ—
ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｐｅｔｒｏｐｈｉｌａＲＫＵ－１
ＬＩＡＯＣｈｅｎ￣ｕｎ，ＺＨＥＮＧＷｅｉ，ＨＵＡＮＧＪｉａｎｆｅｎｇ，ＬＩＵＣｈｅｎｇｌｏｎ￣，ＬＩＵＺｈｉｑｉａｎｇ，
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｈｙｐｅｎｈｅｒｍ０ｐｈｉｌｉｃｇｌｕｃｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅｆｒｏｍＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｐｅｔｒｏｐｈｉｌａＲＫＵ一１（ＴＰＧＩ）ｗａｓ
ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＣＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧ一３，（０
Ｄ一木糖生成Ｄ一木酮糖．在体外催化Ｄ一葡萄糖生
成Ｄ一果糖 …。因此，该酶被广泛用于高果糖浆（ＨＦＣＳ）的工业生产中＿２＿３】。
ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅｏｎＣｏ２￣．ＴｈｅＫａｎｄ —ｔｏｓｕｂｓｔｒａｔｅＤ— ｇｌｕｃｏｓｅｗｅｒｅ３７３ｍｍｏ］］Ｌａｎｄ１３．４Ｕ／ｍｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｙｉｅｌｄｏｆＤ－ｆｒｕｃｔｏｓｅｒｅａｃｈｅｄ５３．８％ａｎｄｔｈｅｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｇｒａｄｕａｌｌｙｍａｉｎｔａｉｎｅｄ
根据ＴＰＧＩ基因序列，设计引物（含限制性酶切位点）上游引物：５一ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＡＡＴＧＧＡＡ１］＿Ｉｒ订ＣＣＣＴＧ一３，（ＮｃｏＩ），下游引物：５一
ｇｌｕｃｏｓｅｗａｓ１９．８Ｕ／ｍｇ．Ｔｈｅｅｎｚｙｍｅｅｘｈｉｂｉｔｅｄｉｔｓｍａｘｉｍｕｍａｃｔｉｖｉｔｙａｔ８５ｏＣ，ｐＨ７．０ａｎｄｓｈｏｗｅｄ
ｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｇｅｎｏｍｅｍｉｎｉｎｇｆｒｏｍＮＣＢＩｄａｔａｂａｓｅ．ＴｈｅｇｅｎｅｏｆＴＰＧ１ｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
和１３．４Ｕ／ｍｇ。在最适条件下，反应在４ｈ内达到平衡，果糖得率最高达到５３．８％。
关键词：基因挖掘；葡萄糖异构酶；表达；酶学性质中图分类号：Ｑ８１４文献标志码：Ａ文章编号：１６７４ — ２２１４（２０１５）０４ — ００１９ — ０５
的迫切需求。目前，基因挖掘作为一种快速、高效、便捷的筛选生物酶催化剂的新型手段，已经越来越广泛
２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈ＠ａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００１４，Ｃｈｉｎａ）