固定化酶与固定化细胞(第六章)

固定化催化剂的特殊应用（ 固定化催化剂的特殊应用（三） 特殊应用 药物控释载体9
药物释放要求： 定点（靶向性）； 定量（太高太低均有害）； 避免被（胃酸、蛋白酶）破坏； 避免引起免疫反应。 措施：聚合物修饰；凝胶包埋；制成微球 制剂或脂质体、具有导向性的药物等。
固定化催化剂的特殊应用（ 固定化催化剂的特殊应用（四） 特殊应用 －－生物传感器
第六章 固定化酶与固定化细胞
固定化酶定义的形成以及扩展
固定化酶是20世纪50年代发展起来的一项新技术， 最初称“ 水不溶性酶 ”（water insoluble enzyme） 和 “ 固相酶 ” （solid phase enzyme),是将水溶性的酶 与不溶性的载体结合起来。 后来，人们发现可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装 置中，高分子底物与酶在超滤膜的一边，反应产物可以 透过膜逸出。这种情况下，酶本身仍处于溶解状态，只 不过是被固定在一个有效的空间内。再用上面的名字已 不合适。 1971年第一次国际酶工程会议上统一称为“ 固定化 酶”。（immobilized enzyme ）是指在一定空间内成闭索 状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后酶可以回收 利用。 “ 固定化的生物催化剂” 包含酶、含酶细胞及微生物 的固定化。1
固定化酶半衰期（T 固定化酶半衰期（T1/2）的测定
测定半衰期的意义：评价固定化方法；生 产上决定更换酶的时机。 定义：从开始到活力只剩一半时所经历的 时间。有使用半衰期，贮藏半衰期等。 方法：直接法测既费时、费力，有时还不 可行（如半衰期很长）。 参考测定放射性元素半衰期的做法，间接 测定。
间接法测定固定化酶半衰期T 间接法测定固定化酶半衰期T1/2
生物催化剂固定化的优点
o 某些酶回到了它在体内的原始状态。 o 可以重复使用，节约了成本。 o 使用时方便得多，对产物抑制型反应既有 利又方便。 o 催化剂易和产物分离，有利于提高产品质 量（如生产针剂药品，最后不能含蛋白 质）。 o 大多数情况下催化剂固定化后稳定性提高。 o 酶反应过程可以控制。 o 较游离酶更适合于多酶体系反应。
评价固定化酶（细胞）的指标 评价固定化酶（细胞）
• 固定化酶的活力是指固定化酶（细胞）
催化某一特定反映的能力。可用在一定条 件下它所催化的某一反映的反应初速度来 表示。单位为每毫克干重固定化酶（细胞） 每分钟转化底物的量umol.min 每分钟转化底物的量umol.min-1.mg-1 • 因固定化酶（细胞）通常是颗粒状，所以 其活力测定要适当改进，以测定过程分类， 可分为间歇测定和连续测定 可分为间歇测定和连续测定
偶联率及相对酶活力的测定
• 偶联率=（加入酶的活力-上清液酶的活力） /加入酶的活力x100% • 相对酶活力=固定化酶的总活力/加入酶的 = / 总活力x100% x100% • 活力回收=固定化酶的总活力/加入酶的总 活力x100% • 偶联率=1时，表明固定化的程度好，固定 化引起的酶的失活不明显。
固定化的缺点
1、固定化过程需成本（人力物力）。 2、固定化酶活力回收率往往不高。 3、载体对于底物和产物的扩散存在 空间障碍（尤其是大分子）。 结论：不是所有的情况下都需固定 化！
固定化时应遵循的原则
尽量减少酶的活力损失和专一性的改变（即 尽量减少酶活性部位的变化和酶高级结构－ 构象－的破坏）。 要有一定的机械强度（保证使用顺利）。 尽量减少空间位阻。 尽可能和载体结合牢固。 所用方法有利于酶稳定性提高。 制备成本要低。
化学结合法--化学结合法---共价结合法4 ---共价结合法
• 载体（必须具有反应基团）：无机物；天然有机 物（尤其是多糖类），合成聚合物。 • 结合力：共价键。 • 优点：酶和载体结合最牢固；半衰期长。 • 缺点：酶活力回收率低；成本较高；载体不能回 收。 • 固定化对象：酶。细胞一般不用此法。 • 操作提示：载体的基团如反应性不强（如多糖的 羟基），可先活化后与酶反应。反应时注意保护 酶的活性中心，必要时可用底物或效应物于反应 前饱和。
o 特点：敏感（感应）元件由生物材料做成。 o 酶电极：酶膜＋电化学传感器（氧电极、 PH电极、阳离子电极等）。 o 酶膜：用交联或其它方法固定的酶。 o 生物芯片：固定化的生物活性物质（如蛋白 质芯片）。 o 应用：和传统生化分析相比，本法检测速度 快，样品量少，生物活性物质可反复使用。
• 可固定的细胞类型：微生物、植物、动物 • 细胞的生理状态分为： • 1、死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞 器） • 2、活细胞（增殖细胞、静止细胞、饥饿 细胞）
固定化细胞的优点
1、固定化细胞的密度大、可增值，可以获得高 度密集工程菌的集合体，不需要微生物菌体的 多次培养、扩大，从而缩短了发酵生产周期， 提高了生产能力。 2、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连 续使用，未来可以将发酵罐变成为反应柱进行 生产。 3、发酵液中含菌体少，利于产品的分离纯化
离 子 结 合
3 法
• 载体：阴、阳离子交换剂（树脂或凝胶） • 结合力：正负离子静电吸引力。 • 优点：结合较物理吸附牢固；酶活力损失 小；半衰期较物理吸附长；载体能回收。 • 缺点：固定化酶牢固程度易受PH影响； 高离子强度可使酶和载体的结合力降低。 • 固定对象：一般用于酶的固定化（细胞分 子量太大）。
结 晶 法
任何溶液要达到结晶水平必须具备两个条 件：一是纯；二是浓（过饱和）。缺一不 可。 结晶靠的是非共价力：离子健、氢键、范 德华引力…… 晶体比无定型的聚集体刚性强。 晶体既是载体又是催化剂本身。 先结晶，后交联，可使结晶更牢固。
分
散
法
• 酶溶液－－脱水得干粉－－分散于非极性有 机溶剂中，可看成为分散的固定化酶。 • 此体系适合于产物不溶于水的反应，如酸加 醇生成酯。 • 酶越分散（最好是单分子），催化效率越高。 • 将酶和亲酯化合物（如聚乙二醇）连接，可 增加酶在有机溶剂中的溶解度（分散度）。 • 将酶用多孔载体吸附，也可增加分散度。
1、先测定并计算固定化酶活力衰减常数Kd ： 测定固定化酶初始酶活E0, 和过了时间t后的酶 活E 。则衰减常数Kd 为： Kd＝（2.303/t）x Lg（E0/E） 2、再计算半衰期： T1/2 ＝0.693/ Kd
固定化催化剂的特殊应用（一） 固定化催化剂的特殊应用（一）
用于基础研究
固定化催化剂最大量、最普遍的应 用是作为工业生物催化剂使用的，这 在酶的应用一章已经讲过。此处只介 绍除此以外的“ 特殊”应用。 酶结构和功能的研究。 生物活性蛋白的定向固定作为揭示 蛋白内部反应和功能的工具。
固定化酶的性质（和溶液酶比较） 固定化酶的性质（和溶液酶比较）
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活力：一般降低。 稳定性（热、pH、蛋白酶、抑制剂、）： 一般升高。 最适温度：一般提高。 最适pH：载体带负电时碱移。 pH 米氏常数Km ： 载体不带电－－ Km一般升高； 载体和底物电荷相反－－ Km降低
细 胞 的 固 定
8 化
辅酶的固定化
－－为什么要固定化辅酶？ －－为什么要固定化辅酶？ 为什么要固定化辅酶
许多酶（约1/3）需要辅酶才能起 许多酶（约1/3）需要辅酶才能起 催化作用； 辅酶分子一般较小，即使在超滤 膜中也易渗漏，因此必须采用特殊 方法固定。
辅酶固定化的要点
辅酶和载体间加间隔臂（手臂），目的是 可以避开大分子载体的空间障碍，能和脱 辅基的酶蛋白（apoenzyme）自由配合。 和可溶性大分子（如PEG）结合后（即 高分子化）可以被限制在超滤膜中和 apoenzyme自由配合。
网 格 法
载体： 1、天然高分子（如海藻胶）先融化，再冷却， 但在凝聚前和催化剂混合，再冷却就成了凝胶。 切割后就成了固定化催化剂。若在搅动情况下 滴到高浓度钙离子中，颗粒强度会增加。 2、合成高分子（如聚丙烯酰胺）：单体在聚 合前和催化剂混合，聚合后催化剂就被包埋在 网格里面了。
微 囊 法6
• 通过各种膜，将催化剂包埋在直径为几微米 的微囊中。 • 多种方法（如界面沉淀法、界面聚合法、二 级乳化法等）可供选择。其中脂质体包埋法 就是将卵磷脂和催化剂混合后用超声波打碎 即可。 下面介绍两种新型固定化方法。
化学结合法－交联法 化学结合法－
• 载体：就是交联剂。交联剂多是含双功能或多功 能基团的试剂。交联剂和酶相互交织在一起。 • 结合力：共价键。 • 优点：同上。另固定化操作比上法容易。 • 缺点：同上。 • 对象：酶、细胞、微生物。酶电极所用酶膜常用 此法制备。 • 操作要点：交联剂浓度不宜太大。操作时要保护 酶活性中心。
间歇测定和连续测定
• 间歇测定（震荡测定）：在搅拌或震荡的反应 器中，再与溶液酶同样的条件下（均匀悬浮于 保温的介质中），然后间隔一定时间取样，过 滤后按常规测定底物的消耗量或产物的生成量 就可以。 • 连续测定（柱法测定）：将固定化酶装入具有 恒温水夹套的柱中，以不同的流速使底物流过 酶柱，收集流出的的反应物。按常规测定底物 的消耗量或产物的生成量就可以。 。
酶的固定化的方法
固定化的方法
非共价结合法 化学结合法 包埋法
分类
物理吸附法、分散法、 离子结合法、结晶法 共价结合法、交联法 微囊法、网格法
物 理 吸 附
2 法
• 载体：无机物－－多孔，机械强度高； 有机物－－天然和合成高分子。 • 结合力：范德华引力，疏水作用力等。 • 优点：酶活力损失小（构象基本不变）， 方法简单。 • 缺点：固定化酶半衰期短（易脱落）。 • 固定对象：酶和细胞都行。
固定化细胞的缺点
• 利用的仅仅是胞内酶，细胞内多种酶的存 在，会形成一些不需要的副产物 • 细胞膜、细胞壁和载体都存在扩散限制作 用 • 载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通 透性
固定化细胞的制备
• 制备方法与固定化酶基本相同 • 微生物菌体本身是天然的固定化酶，经过 适当的条件，例如可经过热处理使其它酶 失活，而保存所需酶的活力，再固定化。 • 固定化完整细胞的方法有多种，但还没有 一种理想的通用的方法，固定化细胞的制 备的总原则就是找到价格低廉、简便的方 法，酶活力保留值要高，操作要稳定。
固定化催化剂的力：一种综合的力（一般不含有共价 键），是生物活性分子之间特有的一种高亲和、 高专一性的作用。这种作用可逆。是生物长期进 化的结果。 亲和分离（亲和层析）：利用某些生物分子（如 抗原和抗体）之间的亲和力进行高效分离。 做法：将互为配体（ligand）和配基（ligate） 中的任何一个固定在固相载体上，用于从混合物 中迅速识别、吸附、浓缩另一个。效率很高。 。效率很高。
包 埋 法5
o 包埋法适用面广，只要生物催化剂体积足 够大，或包埋介质的孔隙足够小，酶不易 渗漏即可，以保证一定的半衰期。 o 采用网格法和微囊法将酶或细胞包埋在一 定的小空间里。此法催化剂和载体一般不 发生反应，所以包埋法酶活力回收率较高。 o 包埋介质孔隙小了会对大分子底物和产物 的流动产生传质障碍。例如聚丙烯酰胺包 埋细胞时浓度不宜太高。