snp分型
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
•针对每个SNP位点设计一 对Taqman探针，用不同的 荧光标记。 •5 ’末端携有报告荧光基团, 3’端标有荧光淬灭基团 •Tag 聚合酶具有外切活性
• 通过散点图显示结果
• 每个数据集代表一种 基因型： 纯合子、杂合子和 无模板对照（NTC）
探针法特点
• 准确度高 • 速度快、通量大 • 适合已知SNP位点，位点数量少，多样本（
点，适宜检测的位点数为8-50个 • 不受SNP位点多态性的限制 • 适用于多位点同时检测，样本数不受限制
，可以是几十到几千
4 HRM(高分辨率熔解曲线分析)
• 在一定温度范围内将PCR扩增产物进行变性并实时 检测荧光信号，荧光值随温度变化即熔解曲线。
• DNA都有其独特的序列，包括长度、GC含量及碱 基的互补性差异，这样每个DNA片段都有独特的 熔解曲线形状。
都能灵活处理； 便宜：引物常规长度，不带标记，多重反应，位点越多越便宜； 污染小：一管式操作，反应体系在实验时始终在一个试管内。
6 Illumina SNP芯片
Illumina SNP应用策略
• Infinium™ Whole Genome Genotyping 全基因组检测
适用于 GWAS、CNV 研究项目
Affymetrix SNP Array 6.0
• 涵盖超过1,800,000个遗传变异标志物：包括超过906,600个SNP和超过 946,000个用于检测拷贝数变化的探针。
482,000个SNPs来自于前代产品500K和SNP5.0芯片；
424,000个SNP包括了源来于国际HapMap计划中的标签SNPs，X、Y染 色体和线粒体上更具代表性的SNPs,以及来自于重组热点区域和500K 芯片设计完成后新加入dbSNP数据库的SNP；
SNP分型
冯静 2012.06.19
主要内容
• SNP相关知识 • SNP检测方法
什么是SNP？
• SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) ，单核苷酸多态性。
• 是基因组核苷酸水平上由单个核苷酸 变异引起的DNA序列的多态性。
• 包括单碱基的转换、颠换、插入、缺 失，其中最少一种形式在群体中的频 率不小于1％。
Ex: SNP= rs123456
Two haptens/colors
Bead
T
AG/G C
WWGGAAtatarrggeett
a
TT
Whole genome amplified DNA
GG
T G
SNP1 b
A-DNP A-DNP
SNP1 c
SNP2
C-Bio C-Bio
SNP2
SNP3 - - - - - SNP
操作流程
• 目标区段扩增 • PCR产物纯化 • SNaPshot反应 • ABI3730测序仪检测
单重位点检测
GG GA AA
AA
SnaPshot多重位点检测
不同位点的引物带 不同长度的尾巴 不同大小扩增产物
颜色代表不同基因型 大小代表不同位点
技术特点
• 分型准确 • 多位点同时检测，每个反应可检测8-12个位
2020年3月
GoldenGate™ 检测 --和独特的带 IllumiCodeTM 编码序列的芯片杂交
illumiCode #561
illumiCode #217
illumiCode #1024
/\/\/\/ /\/\/\/ /\/\/\/
A/A
SNP #561
G/G
SNP #217
C/T SNP #21002240年3月
wk.baidu.com
测序、质谱、TaqMan、SNaPshot、 HRM、Illumina芯片、……
1 直接测序法
• 客户指定检测SNP位点
primerL
A
• 每个位点均需经过PCR扩增然后测序
• 能发现已知和未知SNP位点
• 操作简单，但工作量大，成本较高
• 适用于少数几个位点及样本的检测
G
primerR
2 Taqman 探针法
A-DNP C-Bio
SNP3 - - - - - SNP
Signal Green/Red
TT
GG
TG
目前主要产品
人全基因组分型芯片： Human660W，HumanOmni1，HumanOmni1S， HumanOmni2.5，HumanOmni2.5S，HumanOmni5，中华
牛高密度全基因组分型芯片（BovineHD ，777962位点) 犬全基因组分型芯片（Canine SNP20,22362位点） 犬高密度全基因组分型芯片（ CanineHD,170000左右位点） 马全基因组分型芯片(Equine SNP50,54602位点） 羊全基因组分型芯片(Ovine SNP50,54241位点） 猪全基因组分型芯片(Porcine SNP60,62163位点） 玉米全基因组分型芯片(Maize SNP50,56110位点）
2020年3月
GoldenGate™ 检测 --扩增
Amplification
A
Template
PCR with Common Primers
Cy3 Universal Primer 1
Cy5 Universal Primer 2
illumiCode #561
Universal Primer P3
每张芯片有660K，1M ，2.5M，5MSNP位点
数据库：HapMap Phase 1-3和1KPG(千人基因组计划）
• GoldenGate™ 特定SNP位点检测
适用于用户定制SNP研究（每个芯片可研究48-3072 SNP位点）
Linkage 连锁分析（Human and Mouse)
主要组织相容性（MHC）研究Panel
几千个）检测
3 SnaPshot方法
单碱基延伸原理： 在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP,紧挨多态位点5’
端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引 物延伸一个碱基即终止。
• 同一位点不同等位基因的区分
根据峰的颜色可知掺入的碱基种类
• 不同位点之间的区分
根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位 点。
• SNP是继人类基因组计划之后又一国际研究竞争新 热点，是阐明基因组功能及特点的重要基础。
HapMapProject SNPs
• 单体型图（HapMap）：人类DNA序列中多态位点的常见模 式图。
• 目的：建立一个免费向公众开放关于对人类健康和疾病以及 对药物和环境的反应有影响的相关序列变异的关键信息。
Allele Specific Extension & Ligation
Universal PCR Sequence 1
Universal PCR Sequence 2
Pol[yTme/rCase]
A G
Ligase
[T/A]
illumiCode’ Address
Universal PCR Sequence 3’
• 主要组织兼容性研究芯片（ MHC Panel ） MHC(Major Histocompatibility Complex) 主要组织相容性区域是一段 4Mb 的基因组序列，位于 Chr 6p21 上，包含了 160 个基因。这些基因 中有 40% 与免疫蛋白编码相关，其中也包括了白细胞抗原基因等。 MHC 芯片针对这一区域挑选了 2,400 个平均间隔 2kb 的 SNP 标记，对 该区域的 SNP 进行检测。 MHC 芯片可广泛应用于免疫、移植、疾病 等相关研究。
A T
+Enzyme +ddNTP
Allele 2
Unlabeled Primer (23-mer)
C
Extended Primer (24-mer)
G C
质谱法的优点
准确：检测分子本质特征之一——分子量，没有其他标记； 灵敏：pmol物质即可被检测出； 通量高：2周最高可完成7万个反应； 灵活：以384板形式，最高可至17重反应，无论样本和位点多少，
肿瘤SNP芯片
2020年3月
Infinium 全基因组分型芯片
目前的主流分型芯片
– Infinium II Assay – Human660W和Omni1，
Omni1S，Omni2.5， Omni2.5S，Omni5 – 以HapMap1-3期数据库 和1KGP数据库
Infinium II Assay 单碱基延伸
2020年3月
用户自定义SNP位点检测
GoldenGate™检测—低中通量
•可根据研究需要挑选SNP位点，制作探针组 •芯片规格：
✓48, 96,384,768 ,1536,3072 位点可选 ✓样本数为480的倍数
特定SNP位点检测 GoldenGate™ 检测 --等位基因特异性延伸和连接
Genomic DNA
• 根据曲线可以准确区分野生型纯合子、杂合子和 突变性纯合子。
HRM特点
• 染料：饱和性染料，如LC Green
• 仪器：在熔解曲线阶段，具有细微温度差 异的高捕获率
常规熔解曲线 温度捕获范围：~0.2-0.5度
高分辨率熔解曲线 温度捕获范围：~0.1-0.02度
检测原理
技术优势
• 无需序列特异性探针 • 操作简便快速，成本低 • 可对未知位点进行筛查 • 较高通量
• 确定超过一千万的人类基因组的SNPs，完成了约310万SNPs （≥5％）在270个样品中的分型。 – Yorubans-Ibadan, Nigeria, Africa (YRI) – Caucasian -North & West Europe ancestry; Utah, USA (CEU) – Japanese -Tokyo, Japan (JPT) – Chinese -Han Chinese; Beijing, China (CHB)
GoldenGate技术
1536 位点－ 384 DNA样品 实验数据
2020年3月
• 肿瘤相关 SNP 芯片（Cancer Panel） 选择约 400 个肿瘤相关基因的 >1400 个 SNP 标记，信息来源于美国 NIHSNP500 肿瘤数据库 http://snp500cancer.nci.nih.gov/ 。
5 质谱检测（Sequenom）
• 质谱仪通过对物质分子量（质荷比）进行检测，达到区分、 鉴别物质的目的。
• SNP位点两个等位基因之间存在分子量差异，通过实验将 差异放大，然后以质谱仪进行检测即可。
Allele 1
Unlabeled Primer (23-mer)
T
Extended Primer (24-mer)
镰刀状细胞贫血
正常血红细胞
谷氨酸
镰刀状血红细胞
缬氨酸
携带氧气能力降低，因而出现贫血症状
• 不同人群中SNP的频率分布有差异，而这些差异可 以代表某一人群的遗传差异。SNP研究将帮助我们 寻找新的遗传病的致病基因或易感基因，认识人 种、人群、个体间的遗传差异，疾病与个体差异 的关系，以及个体差异对药物的耐药性存在的不 同反应能力。
SNP研究策略
全基因组研究 （发现/筛选）
高通量
精细定位 （验证）
候选基因/临床研究 低通量
中通量 大样本分型
SNP研究技术路线
对目的基因特殊位置 测序检测是否有新的 SNP位点
寻找tagSNP
筛选候选SNP区域 确定SNP候选区域
候选SNP大样本分型
关联分析 单倍体型分析
数据分析
二代测序数据 Illumina Bead Array Affymetrix SNP 6.0
➢ 转换：嘧啶和嘧啶之间或者嘌呤和嘌呤之间的交换（A↔G，C↔T) ➢ 颠换：嘧啶和嘌呤之间的交换(A/G ↔ C/T)
• 从理论上来看，每一个SNP 位点都可以有3 种不同 的变异形式，形成转换和颠换两种变异，二者之比 为2:1。
• SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为 T(CG中的C常为甲基化的，自发地脱氨后即成为T)。
参考国外文献同样课 题的研究成果 首选外显子和启动子
Taqman SNaPshot Sequenom
定位致病基因\易感基因
SNP检测技术
SNPs检测技术
基于杂 交
区分SNPs位点的 原理方法
基于酶 或PCR
以构象 为基础
直接测 序
凝胶分 析技术
数据的检测 分析手段
荧光检 DNA芯
测技术
片
质谱检 测技术
SNPs in Human Genome
• 人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱 基中共有300万以上的SNPs。
• SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多 态性的90%以上。大多数SNPs是单纯多态性，但也有一些 与疾病的发生有关联，是决定人类疾病的重要遗传基础。
• 通过散点图显示结果
• 每个数据集代表一种 基因型： 纯合子、杂合子和 无模板对照（NTC）
探针法特点
• 准确度高 • 速度快、通量大 • 适合已知SNP位点，位点数量少，多样本（
点，适宜检测的位点数为8-50个 • 不受SNP位点多态性的限制 • 适用于多位点同时检测，样本数不受限制
，可以是几十到几千
4 HRM(高分辨率熔解曲线分析)
• 在一定温度范围内将PCR扩增产物进行变性并实时 检测荧光信号，荧光值随温度变化即熔解曲线。
• DNA都有其独特的序列，包括长度、GC含量及碱 基的互补性差异，这样每个DNA片段都有独特的 熔解曲线形状。
都能灵活处理； 便宜：引物常规长度，不带标记，多重反应，位点越多越便宜； 污染小：一管式操作，反应体系在实验时始终在一个试管内。
6 Illumina SNP芯片
Illumina SNP应用策略
• Infinium™ Whole Genome Genotyping 全基因组检测
适用于 GWAS、CNV 研究项目
Affymetrix SNP Array 6.0
• 涵盖超过1,800,000个遗传变异标志物：包括超过906,600个SNP和超过 946,000个用于检测拷贝数变化的探针。
482,000个SNPs来自于前代产品500K和SNP5.0芯片；
424,000个SNP包括了源来于国际HapMap计划中的标签SNPs，X、Y染 色体和线粒体上更具代表性的SNPs,以及来自于重组热点区域和500K 芯片设计完成后新加入dbSNP数据库的SNP；
SNP分型
冯静 2012.06.19
主要内容
• SNP相关知识 • SNP检测方法
什么是SNP？
• SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) ，单核苷酸多态性。
• 是基因组核苷酸水平上由单个核苷酸 变异引起的DNA序列的多态性。
• 包括单碱基的转换、颠换、插入、缺 失，其中最少一种形式在群体中的频 率不小于1％。
Ex: SNP= rs123456
Two haptens/colors
Bead
T
AG/G C
WWGGAAtatarrggeett
a
TT
Whole genome amplified DNA
GG
T G
SNP1 b
A-DNP A-DNP
SNP1 c
SNP2
C-Bio C-Bio
SNP2
SNP3 - - - - - SNP
操作流程
• 目标区段扩增 • PCR产物纯化 • SNaPshot反应 • ABI3730测序仪检测
单重位点检测
GG GA AA
AA
SnaPshot多重位点检测
不同位点的引物带 不同长度的尾巴 不同大小扩增产物
颜色代表不同基因型 大小代表不同位点
技术特点
• 分型准确 • 多位点同时检测，每个反应可检测8-12个位
2020年3月
GoldenGate™ 检测 --和独特的带 IllumiCodeTM 编码序列的芯片杂交
illumiCode #561
illumiCode #217
illumiCode #1024
/\/\/\/ /\/\/\/ /\/\/\/
A/A
SNP #561
G/G
SNP #217
C/T SNP #21002240年3月
wk.baidu.com
测序、质谱、TaqMan、SNaPshot、 HRM、Illumina芯片、……
1 直接测序法
• 客户指定检测SNP位点
primerL
A
• 每个位点均需经过PCR扩增然后测序
• 能发现已知和未知SNP位点
• 操作简单，但工作量大，成本较高
• 适用于少数几个位点及样本的检测
G
primerR
2 Taqman 探针法
A-DNP C-Bio
SNP3 - - - - - SNP
Signal Green/Red
TT
GG
TG
目前主要产品
人全基因组分型芯片： Human660W，HumanOmni1，HumanOmni1S， HumanOmni2.5，HumanOmni2.5S，HumanOmni5，中华
牛高密度全基因组分型芯片（BovineHD ，777962位点) 犬全基因组分型芯片（Canine SNP20,22362位点） 犬高密度全基因组分型芯片（ CanineHD,170000左右位点） 马全基因组分型芯片(Equine SNP50,54602位点） 羊全基因组分型芯片(Ovine SNP50,54241位点） 猪全基因组分型芯片(Porcine SNP60,62163位点） 玉米全基因组分型芯片(Maize SNP50,56110位点）
2020年3月
GoldenGate™ 检测 --扩增
Amplification
A
Template
PCR with Common Primers
Cy3 Universal Primer 1
Cy5 Universal Primer 2
illumiCode #561
Universal Primer P3
每张芯片有660K，1M ，2.5M，5MSNP位点
数据库：HapMap Phase 1-3和1KPG(千人基因组计划）
• GoldenGate™ 特定SNP位点检测
适用于用户定制SNP研究（每个芯片可研究48-3072 SNP位点）
Linkage 连锁分析（Human and Mouse)
主要组织相容性（MHC）研究Panel
几千个）检测
3 SnaPshot方法
单碱基延伸原理： 在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP,紧挨多态位点5’
端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引 物延伸一个碱基即终止。
• 同一位点不同等位基因的区分
根据峰的颜色可知掺入的碱基种类
• 不同位点之间的区分
根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位 点。
• SNP是继人类基因组计划之后又一国际研究竞争新 热点，是阐明基因组功能及特点的重要基础。
HapMapProject SNPs
• 单体型图（HapMap）：人类DNA序列中多态位点的常见模 式图。
• 目的：建立一个免费向公众开放关于对人类健康和疾病以及 对药物和环境的反应有影响的相关序列变异的关键信息。
Allele Specific Extension & Ligation
Universal PCR Sequence 1
Universal PCR Sequence 2
Pol[yTme/rCase]
A G
Ligase
[T/A]
illumiCode’ Address
Universal PCR Sequence 3’
• 主要组织兼容性研究芯片（ MHC Panel ） MHC(Major Histocompatibility Complex) 主要组织相容性区域是一段 4Mb 的基因组序列，位于 Chr 6p21 上，包含了 160 个基因。这些基因 中有 40% 与免疫蛋白编码相关，其中也包括了白细胞抗原基因等。 MHC 芯片针对这一区域挑选了 2,400 个平均间隔 2kb 的 SNP 标记，对 该区域的 SNP 进行检测。 MHC 芯片可广泛应用于免疫、移植、疾病 等相关研究。
A T
+Enzyme +ddNTP
Allele 2
Unlabeled Primer (23-mer)
C
Extended Primer (24-mer)
G C
质谱法的优点
准确：检测分子本质特征之一——分子量，没有其他标记； 灵敏：pmol物质即可被检测出； 通量高：2周最高可完成7万个反应； 灵活：以384板形式，最高可至17重反应，无论样本和位点多少，
肿瘤SNP芯片
2020年3月
Infinium 全基因组分型芯片
目前的主流分型芯片
– Infinium II Assay – Human660W和Omni1，
Omni1S，Omni2.5， Omni2.5S，Omni5 – 以HapMap1-3期数据库 和1KGP数据库
Infinium II Assay 单碱基延伸
2020年3月
用户自定义SNP位点检测
GoldenGate™检测—低中通量
•可根据研究需要挑选SNP位点，制作探针组 •芯片规格：
✓48, 96,384,768 ,1536,3072 位点可选 ✓样本数为480的倍数
特定SNP位点检测 GoldenGate™ 检测 --等位基因特异性延伸和连接
Genomic DNA
• 根据曲线可以准确区分野生型纯合子、杂合子和 突变性纯合子。
HRM特点
• 染料：饱和性染料，如LC Green
• 仪器：在熔解曲线阶段，具有细微温度差 异的高捕获率
常规熔解曲线 温度捕获范围：~0.2-0.5度
高分辨率熔解曲线 温度捕获范围：~0.1-0.02度
检测原理
技术优势
• 无需序列特异性探针 • 操作简便快速，成本低 • 可对未知位点进行筛查 • 较高通量
• 确定超过一千万的人类基因组的SNPs，完成了约310万SNPs （≥5％）在270个样品中的分型。 – Yorubans-Ibadan, Nigeria, Africa (YRI) – Caucasian -North & West Europe ancestry; Utah, USA (CEU) – Japanese -Tokyo, Japan (JPT) – Chinese -Han Chinese; Beijing, China (CHB)
GoldenGate技术
1536 位点－ 384 DNA样品 实验数据
2020年3月
• 肿瘤相关 SNP 芯片（Cancer Panel） 选择约 400 个肿瘤相关基因的 >1400 个 SNP 标记，信息来源于美国 NIHSNP500 肿瘤数据库 http://snp500cancer.nci.nih.gov/ 。
5 质谱检测（Sequenom）
• 质谱仪通过对物质分子量（质荷比）进行检测，达到区分、 鉴别物质的目的。
• SNP位点两个等位基因之间存在分子量差异，通过实验将 差异放大，然后以质谱仪进行检测即可。
Allele 1
Unlabeled Primer (23-mer)
T
Extended Primer (24-mer)
镰刀状细胞贫血
正常血红细胞
谷氨酸
镰刀状血红细胞
缬氨酸
携带氧气能力降低，因而出现贫血症状
• 不同人群中SNP的频率分布有差异，而这些差异可 以代表某一人群的遗传差异。SNP研究将帮助我们 寻找新的遗传病的致病基因或易感基因，认识人 种、人群、个体间的遗传差异，疾病与个体差异 的关系，以及个体差异对药物的耐药性存在的不 同反应能力。
SNP研究策略
全基因组研究 （发现/筛选）
高通量
精细定位 （验证）
候选基因/临床研究 低通量
中通量 大样本分型
SNP研究技术路线
对目的基因特殊位置 测序检测是否有新的 SNP位点
寻找tagSNP
筛选候选SNP区域 确定SNP候选区域
候选SNP大样本分型
关联分析 单倍体型分析
数据分析
二代测序数据 Illumina Bead Array Affymetrix SNP 6.0
➢ 转换：嘧啶和嘧啶之间或者嘌呤和嘌呤之间的交换（A↔G，C↔T) ➢ 颠换：嘧啶和嘌呤之间的交换(A/G ↔ C/T)
• 从理论上来看，每一个SNP 位点都可以有3 种不同 的变异形式，形成转换和颠换两种变异，二者之比 为2:1。
• SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为 T(CG中的C常为甲基化的，自发地脱氨后即成为T)。
参考国外文献同样课 题的研究成果 首选外显子和启动子
Taqman SNaPshot Sequenom
定位致病基因\易感基因
SNP检测技术
SNPs检测技术
基于杂 交
区分SNPs位点的 原理方法
基于酶 或PCR
以构象 为基础
直接测 序
凝胶分 析技术
数据的检测 分析手段
荧光检 DNA芯
测技术
片
质谱检 测技术
SNPs in Human Genome
• 人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱 基中共有300万以上的SNPs。
• SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多 态性的90%以上。大多数SNPs是单纯多态性，但也有一些 与疾病的发生有关联，是决定人类疾病的重要遗传基础。