红细胞膜蛋白提取流程
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（以上步骤已完成！！）
二、 RBC膜纯化（洗涤）
RBC膜转至 1.5ml塑料管（2个/大组）
9000rpm 5’
沉淀（膜）＋低渗磷酸Buffer（pH7.4) ?ml （吹打）
9000rpm 5’×4
沉淀 ＋等渗磷酸Buffer 1ml 9000rpm 5分钟
沉淀（RBC膜）＋0.6ml等渗Buffer （即为RBC原液）
在标准曲线上查出待测样品的浓度，计算 提取膜的 Pr mg数/ml样品 注意稀释倍数
要求：计算原提取RBC液的Pr含量
五、SDS-PAGE测定膜蛋白分子量
不连续电泳系统： 电泳缓冲液pH离子强度与凝胶中不同（浓缩效应）
（一）垂直板安装 每套板两块玻璃下端对齐， 夹好，放在胶架上！ （二）凝胶制备（见表） 30％凝胶储备液 先配好分离胶（留距齿 梳1cm），待其凝固后， 蒸馏水 再配浓缩胶。 1.5mol/L Tris-HCl （三）电泳装置安装 Buffer 先装内槽，试无渗漏； 1mol/L Tris-HCl 放入外槽中，加Buffer。 Buffer 上样品： 每孔18ul，2块/组 10％SDS 每块板留一标准蛋白孔 10％ 过硫酸铵 （四） 电泳： TEMED 100V进分离胶调至80V 约1.5小时
注意事项： 1.离心步骤一定要“平衡、对称放置” 2.溶血液离心后上清吸取小心，以免丢失“膜” 3. 缓冲液pH7.4，偏酸使Hb残留增加 4.此分离方法适合于人、大鼠；牛、猪等易使 脂蛋白脱落，1mMCaCl2可防止此种膜的不稳 定性。 5.本实验因条件限制，在常温离心。如需保持 蛋白活性，应在4˚C离心。
摇匀，放置１０分钟
立即摇匀，放置15分钟。以第６管为空白管，在分光光度计上以620ｎｍ比色，读取Ａ。 以各管标准蛋白浓度为横座标，各管吸光度值为纵座标作图，画出标准曲线。
2.红细胞膜样品蛋白含量的测定
将待测管1、2同上加入碱性铜及酚试剂，一同测定
作图： 横坐标以标准蛋白含量 纵坐标以A620吸光度值 图比例应为3:2（横：纵） 计算：
实验分组
每个班分三大组，每组十人左右，选出组长 实验进行一大组为单位 1.纯化RBC膜 2.SDS-PAGE 2块胶（一个凝胶架） 3.western blot 4.3-4 人一小组测定蛋白质含量
一.红细胞膜提取制备（低渗法）
原理： RBC置低渗缓冲液(pH7.4)，破裂溶血 －－溶血液。 溶血液置高速离心作用中，去除溶液中Hb和 其它内含物，制得纯净的RBC膜－－称为血影 “ghost”
100
60
9 8 7 6 5 4 3
20
2
1
0.1
0.2
0.3
0.4….
六、western blotting(β-actin鉴定)
1.转膜
将与凝胶块(切去多余部分)一般大小的NC膜、滤纸均浸入转移Buffer中 20分钟，取出，在半干转移槽中按以下顺序放置： (上）阴极端 滤纸-凝胶-膜-滤纸 阳极端（下） 用玻棒滚动去除空气气泡，盖好上盖。 开启电源，调电压时间20 v， 20分钟
四、Lowry法测定膜蛋白含量
1.标准曲线制备
管号 试剂 H2O (ml) 标准蛋白 碱性铜试剂 酚试剂 含标准蛋白ug 0.9 0.1 １ ３ 25 0.8 0.2 １ ３ 50 0.6 0.4 １ ３ 100 0.4 0.6 １ ３ 150 0.2 0.8 １ ３ 200 1.0 __ １ ３ 0 １ ２ ３ ４ ５ ６
红细胞膜蛋白提取鉴定
内容 1. 红细胞膜提取 2. 膜蛋白提取及定量测定（Lowry法） 3.膜蛋白电泳分离、分子量测定 SDS-PAGE 4.western blotting 鉴定β-actin
实验报告要求：
分别按上各点，写出：原理，操作步骤，结果，讨论，结论
手写，A4 纸大小 ，报告首页写明 实验者，专业。
MR
3.半对数图：（六条标准蛋白） （参照统计学散点法） 横坐标为迁移率MR 纵坐标为LogM （直接按每一蛋白分子量标在半对数图中）
4.计算待测样品蛋白质分子量： 选在标准蛋白迁移范围内的相应待测样品中的三 条带，测量距离计算MR，Mw
横坐标为迁移率MR；（六条标准蛋白） 纵坐标为LogM（直接按每一标准蛋白分子量）
6.结果扫描保存
银 染
考马斯亮蓝染色
（1）RBC分离： 15 ml RBC液 2000rpm 5分钟 RBC（沉淀）＋3倍体积等渗磷酸Buffer 2000rpm 5分钟×2 洗净之RBC （2）溶血液制备 RBC加入低渗磷酸buffer（>1:50) (在 烧杯中） 稍搅拌 置冰箱冻格（4˚C）溶血过夜
溶血液，用“水泵”吸去上清。 ！！：膜很轻
每组做好标记（写好名字），交生化室扫描或摄像 保留。
分子量计算
1.测量： cm
a.每条带距离 （起始点至带中心） b.起始至示踪染料距离 2. MR： MR=
24
a
100 62
b
40
条带距离(a)
30
起始至示踪染料距离 (b)
14
预染标准蛋白
分子量 KD
70 55 40 35 25 15
迁移距离 cm
10％分离胶 10 ml
5％浓缩胶 5ml
3.3 4.0 2.5
1.0 4.0
1.0
0.1
0.06（60ul)
0.08
0.06(60ul)
8ul
8ul
加入过硫酸铵，TEMED即刻灌胶。
（五）取胶:
用专用板平面轻轻“橇”开板，推入小平皿中。 注意： 一块半干转移（浸入转移Buffer20min） 另一块考马斯亮蓝染色 染色2小时后，7%醋酸脱色（×4）
2.封闭
将膜取出TBST中洗5’，放置于封闭液中10分钟，用TBST洗5’×3；
3.一抗孵育
将膜放入已放一抗溶液塑料袋中，室温孵育 1小时，用TBST洗5分钟×3；
4.二抗孵育
将膜放入已放二抗溶液的塑料袋中，室温孵育 1小时，用TBST洗5分钟×3；
5.DAB显色
配制DAB显色液 1 ml（适量），取出膜放入DAB溶液中，显色（约10分钟 内）； （试剂盒：蒸馏水1ml ，A、B、C各一滴放入水中）
三源自文库 样品处理：
1.SDS-PAGE用样品处理（一大组）：
0.3ml RBC原液+0.3ml 样品溶解液 沸水浴 5’
2.Lowry法测定用样品处理 (3-4 人/group）：
A. 取0.3ml RBC原液＋ 1.5ml H2O＋ 150ul NaOH 沸水浴 5’ 待测管1： 取A液0.1ml＋0.9ml H2O 待测管2： 取A液0.3ml＋0.7ml H2O
二、 RBC膜纯化（洗涤）
RBC膜转至 1.5ml塑料管（2个/大组）
9000rpm 5’
沉淀（膜）＋低渗磷酸Buffer（pH7.4) ?ml （吹打）
9000rpm 5’×4
沉淀 ＋等渗磷酸Buffer 1ml 9000rpm 5分钟
沉淀（RBC膜）＋0.6ml等渗Buffer （即为RBC原液）
在标准曲线上查出待测样品的浓度，计算 提取膜的 Pr mg数/ml样品 注意稀释倍数
要求：计算原提取RBC液的Pr含量
五、SDS-PAGE测定膜蛋白分子量
不连续电泳系统： 电泳缓冲液pH离子强度与凝胶中不同（浓缩效应）
（一）垂直板安装 每套板两块玻璃下端对齐， 夹好，放在胶架上！ （二）凝胶制备（见表） 30％凝胶储备液 先配好分离胶（留距齿 梳1cm），待其凝固后， 蒸馏水 再配浓缩胶。 1.5mol/L Tris-HCl （三）电泳装置安装 Buffer 先装内槽，试无渗漏； 1mol/L Tris-HCl 放入外槽中，加Buffer。 Buffer 上样品： 每孔18ul，2块/组 10％SDS 每块板留一标准蛋白孔 10％ 过硫酸铵 （四） 电泳： TEMED 100V进分离胶调至80V 约1.5小时
注意事项： 1.离心步骤一定要“平衡、对称放置” 2.溶血液离心后上清吸取小心，以免丢失“膜” 3. 缓冲液pH7.4，偏酸使Hb残留增加 4.此分离方法适合于人、大鼠；牛、猪等易使 脂蛋白脱落，1mMCaCl2可防止此种膜的不稳 定性。 5.本实验因条件限制，在常温离心。如需保持 蛋白活性，应在4˚C离心。
摇匀，放置１０分钟
立即摇匀，放置15分钟。以第６管为空白管，在分光光度计上以620ｎｍ比色，读取Ａ。 以各管标准蛋白浓度为横座标，各管吸光度值为纵座标作图，画出标准曲线。
2.红细胞膜样品蛋白含量的测定
将待测管1、2同上加入碱性铜及酚试剂，一同测定
作图： 横坐标以标准蛋白含量 纵坐标以A620吸光度值 图比例应为3:2（横：纵） 计算：
实验分组
每个班分三大组，每组十人左右，选出组长 实验进行一大组为单位 1.纯化RBC膜 2.SDS-PAGE 2块胶（一个凝胶架） 3.western blot 4.3-4 人一小组测定蛋白质含量
一.红细胞膜提取制备（低渗法）
原理： RBC置低渗缓冲液(pH7.4)，破裂溶血 －－溶血液。 溶血液置高速离心作用中，去除溶液中Hb和 其它内含物，制得纯净的RBC膜－－称为血影 “ghost”
100
60
9 8 7 6 5 4 3
20
2
1
0.1
0.2
0.3
0.4….
六、western blotting(β-actin鉴定)
1.转膜
将与凝胶块(切去多余部分)一般大小的NC膜、滤纸均浸入转移Buffer中 20分钟，取出，在半干转移槽中按以下顺序放置： (上）阴极端 滤纸-凝胶-膜-滤纸 阳极端（下） 用玻棒滚动去除空气气泡，盖好上盖。 开启电源，调电压时间20 v， 20分钟
四、Lowry法测定膜蛋白含量
1.标准曲线制备
管号 试剂 H2O (ml) 标准蛋白 碱性铜试剂 酚试剂 含标准蛋白ug 0.9 0.1 １ ３ 25 0.8 0.2 １ ３ 50 0.6 0.4 １ ３ 100 0.4 0.6 １ ３ 150 0.2 0.8 １ ３ 200 1.0 __ １ ３ 0 １ ２ ３ ４ ５ ６
红细胞膜蛋白提取鉴定
内容 1. 红细胞膜提取 2. 膜蛋白提取及定量测定（Lowry法） 3.膜蛋白电泳分离、分子量测定 SDS-PAGE 4.western blotting 鉴定β-actin
实验报告要求：
分别按上各点，写出：原理，操作步骤，结果，讨论，结论
手写，A4 纸大小 ，报告首页写明 实验者，专业。
MR
3.半对数图：（六条标准蛋白） （参照统计学散点法） 横坐标为迁移率MR 纵坐标为LogM （直接按每一蛋白分子量标在半对数图中）
4.计算待测样品蛋白质分子量： 选在标准蛋白迁移范围内的相应待测样品中的三 条带，测量距离计算MR，Mw
横坐标为迁移率MR；（六条标准蛋白） 纵坐标为LogM（直接按每一标准蛋白分子量）
6.结果扫描保存
银 染
考马斯亮蓝染色
（1）RBC分离： 15 ml RBC液 2000rpm 5分钟 RBC（沉淀）＋3倍体积等渗磷酸Buffer 2000rpm 5分钟×2 洗净之RBC （2）溶血液制备 RBC加入低渗磷酸buffer（>1:50) (在 烧杯中） 稍搅拌 置冰箱冻格（4˚C）溶血过夜
溶血液，用“水泵”吸去上清。 ！！：膜很轻
每组做好标记（写好名字），交生化室扫描或摄像 保留。
分子量计算
1.测量： cm
a.每条带距离 （起始点至带中心） b.起始至示踪染料距离 2. MR： MR=
24
a
100 62
b
40
条带距离(a)
30
起始至示踪染料距离 (b)
14
预染标准蛋白
分子量 KD
70 55 40 35 25 15
迁移距离 cm
10％分离胶 10 ml
5％浓缩胶 5ml
3.3 4.0 2.5
1.0 4.0
1.0
0.1
0.06（60ul)
0.08
0.06(60ul)
8ul
8ul
加入过硫酸铵，TEMED即刻灌胶。
（五）取胶:
用专用板平面轻轻“橇”开板，推入小平皿中。 注意： 一块半干转移（浸入转移Buffer20min） 另一块考马斯亮蓝染色 染色2小时后，7%醋酸脱色（×4）
2.封闭
将膜取出TBST中洗5’，放置于封闭液中10分钟，用TBST洗5’×3；
3.一抗孵育
将膜放入已放一抗溶液塑料袋中，室温孵育 1小时，用TBST洗5分钟×3；
4.二抗孵育
将膜放入已放二抗溶液的塑料袋中，室温孵育 1小时，用TBST洗5分钟×3；
5.DAB显色
配制DAB显色液 1 ml（适量），取出膜放入DAB溶液中，显色（约10分钟 内）； （试剂盒：蒸馏水1ml ，A、B、C各一滴放入水中）
三源自文库 样品处理：
1.SDS-PAGE用样品处理（一大组）：
0.3ml RBC原液+0.3ml 样品溶解液 沸水浴 5’
2.Lowry法测定用样品处理 (3-4 人/group）：
A. 取0.3ml RBC原液＋ 1.5ml H2O＋ 150ul NaOH 沸水浴 5’ 待测管1： 取A液0.1ml＋0.9ml H2O 待测管2： 取A液0.3ml＋0.7ml H2O