辅助生殖技术的研究进展 综述

辅助生殖技术的研究进展

摘要：借助辅助生殖技术出生的儿童在世界上已数十万例,他们的生长发育与自然受孕出生儿童有否存在明显差异受到广泛的关注。本文综述体外受精、卵胞浆单精子注射、胚胎植入前诊断、低温保存技术等辅助生殖技术的妊娠结局,及其出生儿童在不同生长发育阶段(新生儿期、婴儿期、幼儿期、学龄前期、学龄期、青春期)的健康状况。资料表明辅助生殖技术出生儿童的生长发育无明显异常。

关键词：辅助生殖技术的研究进展，辅助生殖技术，辅助生殖的主要技术方法，人工授精（AI），体外受精-胚胎移植（IVF-ET），体外授精，胚胎移植辅助生殖的主要技术方法

世界卫生组织80年代中末期在25个国家的33个研究中心组织了一次采用标准化诊断的不孕症夫妇的调查结果表明，发达国家约有5％～8％的夫妇受到不孕症的影响，发展中国家一些地区不孕症的患者发病率可高达30％。全世界的不孕症人数约为5000-8000万^[1]。据不完全统计，中国育龄夫妇中不孕症患者约占2％～6％，目前还有增加的趋势。其中女性以输卵管因素为主，占40％～50％。男性以少精、阳萎、高密度畸形精子为常见因素^[2]。而传统的药物和手术治疗方法远不能满足患者对生育的需要。人类辅助生殖技术无疑是生物医学领域里的一场革命^[3]，解决了大多数不孕症患者通过其它治疗后仍不能受孕的问题。

1.人工授精（AI）是以非性交方式将精子置入女性生殖道内，使精子与卵子自然结合，实现受孕的方法。人类最早一例成功的AI治疗是John Hunter于1790年为严重尿道下裂患者的妻子进行的配偶间人工受精。至今虽已200多年，但仍是常用的有效有助孕技术。由于精液来源不同，AI分夫精人工授精（AIH）和供精（非配偶）人工授精（AID）。两者适应证不同，AIH治疗:（1）性交障碍;（2）精子在女性生殖道内运行障碍;（3）少、弱症。AID治疗:（1）无精症;（2）男方有遗传疾病;（3）夫妻间特殊性血型或免疫不相容。实施AID治疗时，供精

者须选择身体健康，智力发育好，无遗传病家族史的青壮年。还须排除染色体变异、乙肝、丙肝、淋病、梅毒，尤其是艾滋病（HIV）。血型要与受者丈夫相同。供精精子应冷冻6个月，复查HIV阴性方可使用［2］。因HIV的感染有6个月左右的潜伏期，此时诊断不易确定，所以供精精子一般应从精子库获取。

2. 体外受精-胚胎移植（IVF-ET）该技术是将从母体取出的卵子置于培养皿内，加入经优选诱导获能处理的精子，使精卵在体外受精，并发育成前期胚胎后移植回母体子宫内，经妊娠后分娩婴儿。由于胚胎最初2天在试管内发育，所以又叫试管婴儿技术。

3. 取卵用B超引导经阴道穿刺取卵术取卵。此法不需麻醉切口，也不经过膀胱，避免了尿液对精子的伤害，优于用腹腔镜或B超引导经腹取卵的方法。

4.体外授精将取到的卵泡液注入培养皿，肉眼快速辨认含卵细胞及其外周的透明带、放射冠的卵冠丘复合物。在解剖镜下确认有卵细胞存在后，置入CO 2 培养箱培养4～8h，再根据复合物的形态变化判断选择成熟卵细胞，按每卵配10～20万个精子的比例，投入经过洗涤优选已诱导获能的精子，授精后16～18h 观察情况，将受精卵移入培养试管/皿内培。

5. 胚胎移植于取卵后48h，胚胎发育成2～8个细胞阶段或在取卵后72h 胚胎发育至8～16个细胞时植入子宫。后者较符合自然受精胚胎进入子宫的时间，且在传统体外培养条件下，只有最健康的胚胎才能活到3天，故移植成功率高。有报道，应用共培养术，可使胚胎培养至囊胚期再移植，妊娠率高达50% 。一次移植的胚胎数以2～3枚为宜。因为增加胚胎移植数，妊娠率虽呈不按比例的增加，但多胎率也会随之增加，经对几组移植1～6胎资料的比较，其中以移植3个胚胎的妊娠率相对较高，而多胎率相对较低。

辅助生殖技术是近年解决不孕不育的重要手段.辅助生殖技术在卵母细胞的体外培养、卵巢及卵母细胞的冻存、卵巢的激活、胚胎的体外培育及移植等诸多方面已取得了不小的成绩,为人类生殖做出了巨大贡献.但辅助生殖技术仍存在许多问题,如胎儿出生后遗传印记的缺失,其机制还有待进一步研究.辅助生殖技术远期安全性也是值得重视的问题.辅助生殖技术有广阔的发展前景,值得辅助生殖工作者进行大量深入的研究并不断完善.

1978年世界首例试管婴儿的降生开创了不孕症治疗的新纪元，也对生命科

学的发展产生了深远的影响，由此而衍生的胚胎干细胞研究被"Science"杂志评为20世纪十大科技成就之首，位居人类基因组计划之前。由试管婴儿为基础而发展起来一系列衍生技术统称为人类辅助生殖技术，是目前治疗不孕症的十分有效而安全的方法。继国内首例腹腔镜下配子输卵管内移植术后，经过10年的努力，我们不仅取得了一系列辅助生殖技术的成功，包括体外受精胚胎移植术(IVF_ET)，俗称试管婴儿，卵母细胞内单精子注射术(ICSI)，睾丸或副睾穿刺单精子注射术(PESA/TESA)，赠卵试管婴儿，胚胎冷冻复苏，人工孵化，多胎减胎术等，而且技术水平不断地提高和成熟，目前已常规应用于临床，为湖北省乃至全国各地的不孕家庭带来了幸福和欢乐。自1997年～2005年5月共进行辅助生殖技术4375例，其中冷冻胚胎复苏移植555个周期，妊娠1418例，已分娩948例，获活婴1260个。平均妊娠率达到35.7％，累计妊娠率39.7％，着床率达17.8％，并于2002年10月通过卫生部论证评审，获得实施人类辅助生殖技术的准入资格证书。此外，我们在国内率先开展玻璃化冷冻的基础和临床研究，取得了国内首例玻璃化冷冻复苏婴儿的出生，目前玻璃化冷冻已成为本中心胚胎冷冻的另一项选择，妊娠率高达19.7％。与此同时，以辅助生殖技术作为平台，我们对生殖医学的基础进行了一系列研究，包括玻璃化冷却的基础研究，子宫内膜接受性的研究，其中Hoxa10在胚胎着床中的分子机制研究也获得了阶段性的进展，为进一步深入进行着床机理的研究奠定了基础；利用废弃和冷冻胚胎进行囊胚培养和干细胞建系的研究均取得了阶段性或突破性的进展。此外，还进行了以下创新性研究：首先开展中国汉族人CYP11a微卫星多态性与PCOS高雄激素血症的关系的研究；率先开展关于第一极体的形态与人卵母细胞非整倍体的关系的研究；率先发现并进行了人类胚胎培养系统污染发生率、污染来源及其预防机制的研究。生殖医学作为一门基础与临床相互渗透、相互依存的交叉性学科，其相关的临床及实验技术具有极其重要的推广应用价值。该系列科学技术成果不仅可在IVF-ET的临床及实验室中推广，还可应用于产前优生诊断、胚胎干细胞的培养及诱导分化、胚胎着床机制等相关前沿研究领域。玻璃化快速冷冻胚胎技术的开展以及胚胎培养系统污染来源的研究可为众多发展中的生殖中心提供可参考的技术模板；种植前遗传学诊断技术在分子水平扩展了早期产前优生诊断方法；利用D3天废弃胚胎建立的胚胎干细胞系，不仅部分解决了建立胚胎干细胞库过

程中胚胎来源困难的问题，并成为进一步行干细胞诱导分化研究的细胞来源；通过人子宫间质细胞与人早期胚胎共培养建立的胚胎着床模型，为复杂的胚胎着床机制的阐明创建了一有利的研究平台。

6. 卵子胞浆内单精子注射(ICSI)的优点和问题 ICSI为男性因素而不孕夫妇的治疗带来了革命性的的突破，成为用助孕技术治疗男性不孕症的首选方法。ICSI不仅解决了以往无法解决的由男方因素给不孕夫妇带来的巨大痛苦，同时也为生殖基础研究开辟了新的途径，而且促使克隆动物的成功，其意义非常重大。

ICSI的临床实践证明，它不仅克服了IVF、PZD、SZI等技术的一系列不足和限制，而且促使卵子受精率明显升高到50～66%，有的高达70%或更高〔3〕。尤其值得注意的是“ICSI婴儿”和“试管婴儿”之间的出生缺陷发生率并无差别。据比利时一组较多例数的统计，迄至1995年已有904例借助ICSI而妊娠的妇女，1996年已有877例ICSI新生儿出生。“ICSI婴儿”和“IVF婴儿”的4种主要的出生缺陷分别为2.6%和2.1%，而1980～1990欧洲联合调查一般人群中新生儿出生缺陷为2.18%，三者之间无统计学差别。这些结果消除了人们当初对ICSI新生儿先天性畸形的担心。因此，ICSI目前已在全球许多国家广泛开展，在我国也有一些单位已成功地引进这一技术，并取得了可喜的成果，一些单位正在奋起直追。然而，近年来对精子发生基因调控和对男性生育力低下和无精子症的基因筛选研究结果促使国际学术界发出警告：ICSI在治疗男性不育症的同时也将一些影响男性生育异常的染色体或突变基因下传，并有可能传播更多的遗传缺陷给下一代的潜在危险。

现已知男性不育中仅有＜5%的病例属常规方法可以治疗的，绝大多数的生育力低下，无精子，严重少精子或少、弱、畸形精子综合征患者是由于染色体数量和结构异常或各种基因突变所致。前者包括性染色体和常染色体畸变，后者包括生殖系统特异表达的基因突变，调控性分化和性腺发育的基因突变和常染色体基因突变。由这些因素导致的男性不育统称为人类精子发生的遗传性疾病〔4，5〕。正是这类不育病人是求助于ICSI的大多数。只要能从这些病人的附睾、睾丸中获得精子、甚至圆形精子细胞注射(ROSI)或圆形精子细胞核注射(ROSNI)也可使卵子受精。因为通过ICSI使卵子受精的条件比较简单，只要有亲代的基因组和有功能的细胞微管组织中心(Microtubule Organizing Center, MTOC)的存在即可通过ICSI使卵子受精。人的MTOC由中心体形成，并由父亲遗传〔6〕，而不管是否有基因缺失或突变。如果将携带染色体畸变或基因突变的精子通过ICSI注入胞浆内就可使卵子受精，从而可能将上诉各种人类精子发生的遗传性疾病传给下一

代。所以可以想象，这些新出生的ICSI下一代完全有可能在其青春期后再现其父的悲剧。尤其是Y染色体微缺失可代代相传〔7，8〕。据报道，Y染色体缺失的发生率在少精子患者中为2.1～26.1%，在无精子组中波动于0～31.2%之间，而在有生育能力的正常对照组中并未发现〔4〕。已筛选的899例病例中，仅AZF a,b,c(无精子因子a,b,c)区带的各种Yq缺失占60例(6.67%)，其中DAZ(Deleted in azoospermia)的发生率最高(45.7%)〔9〕。在一组55例ICSI侯选者中，包括5例精索静脉曲张，25例原因不明的不孕和18例隐睾患者的筛选中发现，Y染色体微缺失各占1例，分别为20%，4%和5%。当前已报道至少3例精索静脉曲张患者有Y染色体微缺失。因此有人惊呼：“遗传缺陷可在不知不觉中通过ICSI传播给下一代”，而现在已知的男性不育的遗传缺陷仅是“刚浮出水面的冰山之一角”〔4〕。当然，由于有严重的遗传缺陷之胚胎可能不着床或发育不良而流产等原因，不能说各种遗传缺陷都能传给ICSI的下一代，但的确反映出人们对ICSI

后代可能出现的遗传缺陷的担忧徒增。

综上所述，可见ICSI存在的问题中最主要的是可能将多种遗传缺陷传给ICSI后代。此外，由于以下原因可能还有更多潜在的危险。①ICSI避开自然受精过程中的多种天然屏障对精子的筛选，特别是宫颈和透明带这两大屏障的筛选作用。②正是求助于ICSI的病人的精子或圆型精子细胞可能存在更多的缺陷。这是因为精子发生过程中，特别是减数分裂和精子形成的后两个阶段中的基因调控极其复杂，并存在一系列的“遗传脆弱性”而失掉生殖细胞的自我监护、淘汰机制。DNA的复制、重组和修复等分子过程极易出错而产生一些异常的配子〔11，12〕而人们对这些缺陷可通过ICSI遗传给后代的危险尚缺乏足够的认识。③实际存在两种遗传物质，即核DNA和胞浆DNA。为精子鞭毛运动提供能量的精子线粒体的遗传物质(mt DNA)是胞浆DNA，有极大的特殊性。mt DNA裸露在胞浆中，能产生大量活性氧而缺乏保护系统，更无足够的DNA修复能力，因而其突变率比核DNA高60～100倍。国外已发现精子活力与多种mt DNA缺陷有关〔13〕。虽然mt DNA 经母遗传，但现已有证据提示父亲线粒体DNA突变可通过ICSI遗传给下一代〔14〕。此外，对男性配子遗传途径尚有很多未知。但已知线粒体疾病的特性是可能累及有丝分裂后的体细胞或组织，其中包括睾丸的Leydig和Sertoli细胞。睾丸的这两种细胞是最易受到mt DNA累积突变所损伤的靶标。因此，应用具有mt DNA 缺陷的精子做ICSI，后代的Leydig和Sertoli细胞功能是否正常已引起人们的极大关注〔15〕。如果采用ROSNI或ROSI则对ICSI后代生殖健康的潜在威胁更大，因为完成减数分裂后的圆形精子细胞之间仍通过“细胞间桥”进行遗传物质的交换，即单倍体细胞起双倍体细胞之功能〔16〕。④ICSI本身也可能无意中损伤卵子的超微结构。因此，我们在应用ICSI这一革命性的先进技术于临床实践时，绝不能仅仅满足于ICSI新生儿的出生缺陷并不高于IVF或与一般人群中的出生缺陷相似，而应考虑到一些现实和更多的潜在的危险性。虽然最近几年这种危险

已引起国际上的高度重视，但由于缺乏可靠的检测手段和适当的动物模型不能对精子或圆型精子细胞行注射前的有效筛选〔10〕，而用ICSI方法治疗男性不育却日益普及。因此，可以想象随着这一技术的广泛开展，对ICSI后代的生殖健康所造成的潜在危险将日益增大。

7.在开展ICSI时应采取的对策当前国际学术界建议在开展ICSI时应采取的对策可归纳为：①对求治对象进行严格的遗传咨询，晓以ICSI的收益、效果及可能的危险性，给以充分自愿选择的机会，这是个严肃的伦理问题；②严格筛选对象，采用包括细胞遗传学和分子遗传学的检测手段，尽可能明确或排除遗传缺陷；③开展种植前基因诊断(PGD)排除有遗传缺陷的男性胚胎，作为最后把关手段，但可移植女性胚胎；④对已出生的ICSI后代进行长期随访；⑤建立适当的动物模型

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2009级临床2班

买日丹。牙生

学号：P092214556

2010/11/8